رنگها و رنگ آمیزی در میکروبیولوژی

[مونمونی 709]

رنگها و رنگ آمیزی در میکروبیولوژی

 

 

برای رنگ آمیزی باکتریها ابتدا نیاز به تهیه یک گسترش میکروبی از باکتری مورد نظر دارید برای این کار اعمال زیر را انجام دهید.

طرز تهیه گسترش میکروبی روی لام :

ابتدا یک لام تمیز را برداشته و یک قطره آب مقطر روی آن بریزید بعد در شرایط استریل با استفاده از نوک آنس که آنرا توسط شعله استریل نموده اید، مقداری از پرگنه باکتری را در کنار شعله از روی محیط کشت برداشته و آنرا در یک قطره آب تا حدود 4/1سطح لام پخش کنید .

در محیطهای مایع دیگر نیاز به قطره آب نمی باشد . شما می توانید با آنس نوک گرد یک لوپ یا بیشتر از باکتری رشد کرده در محیط مایع را برداشته و آنرا روی سطح لام پخش کنید. بعد بگذارید لام در مجاورت جریان هوا خشک شود . بعد از خشک شدن نوبت به تثبیت گسترش روی لام می شود که این عمل توسط حرارت صورت می گیرد یعنی لام را چند بار از روی حرارت شعله عبور دهید تا گسترش میکروبی روی لام تثبیت شده و در جریان رنگ آمیزی از روی لام کنده نشود.

 

انواع رنگ آمیزی میکروارگانیسمها

1-رنگ آمیزی ساده :

در این روش رنگ آمیزی فقط مورفولوژی (شکل ظاهری ) باکتریها مشخص می شودو باکتریها یکرنگ دیده می شوند و چون یک نوع رنگ در این رنگ آمیزی استفاده می شود آن را ساده می نامند.

از این نوع رنگ آمیزی می توان به رنگ آمیزی متیلن بلو به روش لوفلر اشاره نمود. روش رنگ آمیزی ساده متیلن بلو:

ابتدا یک گسترش از باکتری مورد نظر تهیه کرده بعد از طی کردن مراحل مربوط به تهیه گسترش ، لام چند قطره از محلول رنگی متیلن بلو را روی گسترش ریخته و بگذارید رنگ بمدت 1 دقیقه با گسترش واکنش دهد . بعد گستره رنگ شده را با پنس گرفته و لام را بحالت مورب نگه دارید تا باقی مانده رنگها به داخل تشتک یا ظرف رنگ آمیزی بریزد . در همین حالت رنگهای اضافی را با آب مقطر بشویید. لام را به آرامی با کاغذ خشک کن پاک کنید تا آب آن گرفته شود . هیچگاه کاغذ خشک کن را روی گستره نکشید زیرا باعث پاک شده یا از بین رفتن آن می شود.

دقت کنید در طی این مدت رنگ آمیزی ، رنگ روی گسترش خشک نشود چون در این حالت رنگ خشک شده متبلور شده و سطح باکتری را می پوشاند و آنرا غیر قابل روئیت می کند . جهت جلوگیری از این حالت تبلور باید از مقدار کافی محلول رنگی استفاده کرده و بعد از خالی کردن آن ، سطح لام را بلافاصله بشوئید.

طرز تهیه محلول رنگی متیلن بلو5/0%:

-کلرور آبی متیلن بلو5/0گرم

-آب مقطر 100سی سی

آبی متیلن را در آب مقطر حل کنید.

 

2-رنگ آمیزی مرکب

در این نوع رنگ آمیزی ازدو نوع رنگ استفاده می شود که دارای مراحل مختلفی می باشد . در این نوع رنگ آمیزی که در واقع یک نوع رنگ آمیزی افتراقی می باشد از یک محیط کشت باکتری مجهول ، گسترش تهیه کرده و با شیوه های خاص آنرا رنگ آمیزی نموده و با بررسی میکروسکوپی آن و انجام تستهای اختصاصی دیگر می توان نوع باکتری و بیماریزا بودن آنرا تشخیص داد.

از انواع رنگ آمیزی مرکب می توان نمونه های زیر را نام برد:

1-رنگ آمیزی گرم – برای تشخیص نوع باکتری از لحاظ گرم مثیت و گرم منفی بودن آن .

2-رنگ آمیزی اسید فاست زیل – نیلسون – بطور اختصاصی جهت رنگ آمیزی و تشخیص جنس مایکوباکتریوم و بعضی از گونه های جنس نوکاردیا که هر دو بیماریزا هستند ، می باشد.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل در انسان و مایکوباکتریوم لپرا عامل بیماری هانسن یا جذام است .

[Matin H-d 18,145]

برای مشاهده این محتوا لطفاً ثبت نام کنید یا وارد شوید.

• ورود
• یا
• ثبت نام

آندوسپورهای (هاگهای) باکتریایی ، ساختارهای کروی و یا بیضی شکل کوچکی هستند که نسبت به دمای بالا ، تشعشع و وجود مواد شیمیایی از قبیل ضد عفونی کننده ها بسیار مقاوم هستند . هاگها به شکل درون سلولی توسط برخی از باسیلها تولید می شوند به همین دلیل به آنها آندوسپور می گویند. آندوسپورها از سلولهای مولد کوچکترند و مشخصات متقاوتی دارند که قابل توجه تر از همه مقاومت زیاد آنها نسبت به شرایط نامساعد است .

هاگ بخشی ازچرخه زندگی بعضی از جنسها باکتریها می باشد و در واقع هاگ یک مرحله خفته یا غیر فعال از زندگی باکتری است . هاگزایی در باکتریها بر خلاف آنچه در بعضی گیاهان عالی دیده می شود ، نوعی تکثیر تولید مثلی نیست. زیرا هر باکتری فقط یک هاگ تولید می کند و هر هاگ به نوبه خود به یک سلول رویشی (باکتری فعال) تبدیل می شود. بنابراین در گونه های مولد هاگ مانند سایر گونه های باکتریایی تکثیر از طریق تقسیم دوتایی باکتری انجام می شود.

وجود هاگ در کشت باکتریها برای تشخیص و تفکیک آنها اهمیت دارد ، زیرا تشکیل هاگ اساسا محدود با باکتریهای گرم مثبت میله ای شکل در دو جنس باسیلوسها و کلستریدیومها است .

اندازه و محل قرار گرفتن هاگ در داخل باکتری نیز برای تشخیص ارگانیسمها اهمیت دارد مثلا هاگها می توانند در مرکز ، نزدیک به انتها و یا در انتهای یاخته قرار بگیرد. قطر هاگ می تواند بزرگتر و یا کوچکتر از خود باکتری باشد . اگرهاگ قطر بیشتری نسبت به یاخته رویشی داشته باشد موجب تورم یا بزرگی و تغییر شکل باکتری می شود.

 

تعدادی از باسیلهای هاگزا از عوامل مولد بیماری هستند . کلستریدیومهای بی هوازی از مشهورترین آنها هستند. کلستریدیوم بوتولینوم موجب مسمومیت غذایی (بوتولیسم) کشنده می شود. کلستریدیوم پرفرنجنز مولد قانقاریای گازی (شاربن علامتی) و کستریدیوم تتانی مولد کزاز(تتانوس) است . تمام این کلستریدیومهای اسپورزا اگزوتوکسینهای (سم خارجی)قوی تولید می کنند که اغلب کشنده هستند. قویترین اگزوتوکسین توسط کلستریدیوم بوتولینوم تولید می شود. مصرف مقدار بسیار کم از ماده غدایی دارای سم بوتولیسم معمولا موجب مرگ می شود. یک شیشه کوچک نوشابه حاوی سم بوتولیسم برای کشتن تمام مردم کره زمین کافی است .

هاگهای کلستریدیوم پرفرنجنز و کلستریدیوم تتانی در خاک و بنابراین در مواد کثیف و غذا وجود دارند. در هر دو بیماری هاگها توسط خاک و یا مواد خاک آلود داخل زخم می شوند. اگزوتوکسین قانقاریای گازی و کزاز در مقایسه با بوتولیسم کندتر عمل می کند بنابراین از طریق تلقیح آنتی توکسین می توان آنها را خنثی کرد. به دنبال خنثی سازی برای کشتن باکتریهای مولد توکسین از آنتی بیوتیک استفاده می شود و بافتهای آسیب دیده را قطع می کنند تا شریاط بی هوازی از بین برود. در واقع معالجه بموقع موجب نجات از مسمومیت ناشی از این دو باکتری می شود.

طریقه کشت باکتریهای بی هوازی در آزمایشگاه به این ترتیب است که بعد از انتخاب محیط کشت مناسب جهت کشت باکتری مورد نظر پلیت را در وسیله ای بنام جار بیهوازی قرار می دهند تا این وسیله شرایط یک محیط بیهوازی را برای باکتری ایجاد نماید .

عملکرد جار بیهوازی به این صورت است که بعد از قرار دادن پلیتها در داخل آن از گاز پک استفاده می شود. که بعد از بسته شدن کامل درب جار سطح گاز پک را با آب آغشته کرده و آنرا داخل جار قرار دهید . عملکرد گاز پک به این صورت است که مواد داخل گاز پک در طی واکنش با آب اکسیژن محیط داخل جار را مصرف کرده و با حذف اکسیژن محیط شرایط بیهوازی برای رشد باکتری فراهم می شود. برای نشان دادن صحت کار از نوارهای اندیکاتور استفاده می شود . این نوارهای باریک حاوی موادی استکه در حالت عادی برنگ آنی می باشد و هنگامی که اکسیژن از محیط حذف می شود این مواد هم تغییر رنگ داده و بحالت بی رنگ در می آید . پس برای نمایان شدن شرایط بیهوازی محیط یک عدد از این نوارها را هم داخل جار می اندازید. بعد از سپری شدن مدت لازم برای رشد باکتری شما می توانید رشد کلنی ها را در پلیتها مشاهده کنید.

به دوطریق می توان هاگها را زیر میکروسکوپ مشاهده نمود :

1- چون هاگ پوشش مقاومی است که در برابر نفوذ رنگ مقاومت می کند بنابراین در رنگ آمیزی معمولی می توان هاگها را به صورت ناحیه رنگ نشده در داخل سلول رویشی (باکتری مولد) مشاهده نمود.

2- اگر تعداد هاگهای موجود کم باشد و یا اگر از داخل باکتری مولد خارج شده و در گستره به صورت پراکنده باشند اغلب توسط رنگ آمیزی ساده و یا گرم قابل مشاهده نخواهند بود.

رنگ آمیزی شفر- بولتون یک رنگ آمیزی افتراقی است که برای مشاهده آندوسپور و سلول رویشی (مولد) ابداع شده است. با استفاده از این روش خود هاگ رنگ می گیرد و هاگهای آزاد به آسانی قابل روئیت خواهند بود. در این روش برای نفوذ رنگ اولیه (مالاشیت گرین) به داخل پوشش هاگ از حرارت استفاده می شود . همان خصوصیاتی که رنگ آمیزی هاگ را مشکل می کند ، رنگ را پس از نفوذ آن به داخل هاگ بخوبی حفظ می کند.مالاشیت گرین به آسانی از باکتریهای مولد شسته می شود زیرا دیواره سلولی باکتریهای بدون هاگ بر اثر حرارت آسیب دیده و پاره شده است بنابراین سلول رویشی رنگ دوم ، یعنی سافرانین را جذب می کند.

در مشاهده میکروسکوپی لام رنگ آمیزی شده ، هاگها درون سلول رویشی سرخ رنگ ، بصورت بخشهای بیضوی یا کروی کوچک سبز رنگ مشاهده می شوند.

رنگ آمیزی هاگ به روش شفر- بولتون :

از یک باکتری مولد هاگ مانند باسیلوس سوبتیلیس گستره ای تهیه کرده و طبق معمول آنرا با حرارات تثبیت کنید.

1- لام را به رنگ مالاشیت گرین آغشته کنید.

2- لام آغشته به رنگ را حرارت دهید تا رنگ بخار شود . این عمل را با وارونه کردن شعله گاز بر روی لاک و عبور شعله به تناوب از روی رنگ انجام دهید.وقتی که رنگ شروع به بخار شدن کرد شعله را کنار ببرید همینکگه تبخیر متوقف شد دوبار کار را تکرار کنید و نگذارید رنگ بجوشد . مدت 3 تا 5 دقیقه به ترتیب ذکر شده عمل کنید و اگر مالاشیت گرین کاملا از روی لام تبخیر شد دوباره مقداری رنگ به لام اضافه کنید.

3- بگذارید لام سرد شود تا از شکستن آن جلوگیری شود . به موازات سرد شدن لام به اضافه کردن رنگ ادامه دهید زیرا رنگ هنوز در حال تبخیر است .

4- رنگ اضافی را از روی لام خالی کنید و بمدت 30 ثانیه لام را با آب بشوئید.

5- لام را روی تشتک رنگ آمیزی قرار داده و آنرا با رنگ دوم (سافرانین) آغشته کنید و بگذارید یک دقیقه بماند .

6- رنگ اضافه را خالی کرده و لام را بشوئید.

7- لام را به دقت خشک کنید و بگذارید در هوا خشک شود.

لام رنگ آمیزی شده را توسط عدسی 100 همراه با روغن سدر مشاهده کنید. اسپورها گرد و یا بیضی برنگ سبز و سلولهای رویشی ، قرمز دیده می شوند.

طرز تهیه رنگها و محلولها:

- مالاشیت گرین (محلول 5/.%)

5 گرم مالاشیت گرین را در 100سی سی آب مقطر حل کنید.

- سافرانین (محلول 5/.%)

5/.گرم سافرانین را در 100سی سی آب مقطر حل کنید.

 

[Matin H-d 18,145]

رنگ آمیزی باکتری ها:

قسمت اول:

نحوه آماده سازی لام جهت رنگ آمیزی

1-تهیه گسترش:

گسترش میکروبی ممکن است از محیط کشت مایع یا جامد تهیه شود ابتدا بر روی یک لام ساده و تمیز یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی قرار می دهیم. فیلدوپلاتین را استریل کرده (بوسیله شعله ) و سپس با قرار دادن آن در کناره محیط کشت جایی که فاقد باکتری باشد خنک می کنیم. بوسیله فیلدوپلاتین حلقوی ازسوسپانسیون,باکتری برداشت کرده روی لام قرار می دهیم و آن را پخش می کنیم. باید توجه داشته باشیم که در محیط های جامد کلنی باکتری را از منطقه 4 پلیت برداشت کنیم.کلنی باکتری را بوسیله فیلدوپلاتین در داخل آب پخش می کنیم. لامل را تحت زاویه 45 درجه بر روی لام قرار می دهیم. یک گسترش خوب گسترشی است که بعد از خشک شدن بر سطح لام یک لایه نازک سفید ظاهر شود.

2-خشک کردن گسترش:

لامی را که به طریقه بالا تهیه شده است را در معرض هوا یا در مجاورت گرما قرار می دهیم تا گسترش روی لام خشک شود.

3-ثابت کردن (فیکساسیون):

جهت ثابت کردن از حرارت مستقیم استفاده می کنیم.البته باید دقت کرد که حرارت آنقدر زیاد نباشد تا عناصر سلولی و میکروبها سوخته و غیر قابل تشخیص گردند و آنقدر هم کم نباشد که میکروبها ثابت نشوند.

برای ثابت کردن لام خشک شده را سه مرتبه از بالای شعله عبور می دهند و هر بار باید مقدار حرارت به قدری باشد که پشت دست را نسوزاند.در مواردی که با ساختارهای حساس باکتری مانند کپسول و تاژه کار می کنیم این مرحله حذف می شود.

نکته : برای تهیه گسترده از محیط کشت مایع ابتدا لوله را به آرامی تکان می دهیم تا باکتری های ته نشین شده را در محیط پخش کنیم.

نکته: گسترش را به اندازه 4/1 سطح لام پخش می کنیم.

انواع رنگ آمیزی :

رنگ آمیزی ساده : جهت مشاهده شکل و مورفولوژی باکتری و آرایش آنها

رنگ آمیزی افتراقی :

1-رنگ آمیزیهای متداول :

رنگ آمیزی گرم

رنگ آمیزی اسید فست

 

 

 

2-مشاهده ساختمان های مختلف :

رنگ آمیزی کپسول

رنگ آمیزی اسپور

رنگ آمیزی هسته

رنگ آمیزی تاژه

 

رنگ آمیزی ساده :

برای مقایسه شکلها و بررسی آرایش سلولهای باکتری است .در رنگ آمیزی ساده ترجیحا از رنگهای بازی (کروموژن با بار مثبت ) استفاده می شود زیرا اسیدهای نوکلئیک و ترکیبات خاص دیواره دارای بار منفی بوده و با کروموژنهای کاتیونیک پیوند برقرار می کنند.متداولترین نوع رنگهایی که در این نوع رنگ آمیزی استفاده می شود عبارتند از:

متیبن بلو, کریستال ویوله و کربول فوشین

[Matin H-d 18,145]

قسمت دوم

مراحل انجام کار رنگ امیزی ساده:

1-تهیه گسترش از باکتری مورد نظر

2- خشک کردن گسترش در مجاورت هوا

3- فیکسه کردن گسترش در مجاورت هوا

4- ریختن چند قطره رنگ متیلن بلو یا کریستال ویوله یا کربول فیشن برای 1 تا 2 دقیقه

5- شستشوی گسترش با آب به منظور خارج کردن رنگ اضافی از روی لام

6- استفاده از کاغذ جهت خشک کردن گسترش

7- بررسی میکروسکوپی

در طی مرحله 4 لام را باید به صورت افقی و در مرحله 5 باید لام را به صورت موازی با جریان آب نگهداشت.

در این نوع رنگ آمیزی برحسب نوع رنگ بکار برده شده میکروب ها به سه رنگ مختلف دیده می شوند:

رنگ آبی (متیلن بلو )

رنگ بنفش (کریستال ویوله )

رنگ قرمز(کربول فوشین )

رنگ آمیزی گرم :

یکی از متداول ترین رنگ آمیزی ها در آزمایشگاه میکروبشناسی می باشد که نخستین بار کریستین گرم در سال 1884 این روش را ابداع نمود و باکتری ها را به دو گروه اصلی تقسیم کرد:

باکتری گرم منفی و باکتری گرم مثبت

مراحل رنگ آمیزی گرم:

مراحل 1تا 3 را انجام می دهیم.

4-افزودن رنگ اولیه :

در این مرحله رنگ کریستال ویوله افزوده می شود به مدت 1دقیقه

5-سشتشو با آب

6- افزودن محلول لوگول که یک محلول تثبیت کننده است به مدت 1 دقیقه

7-شستشو با آّب

8-افزودن محلول رنگ بر ( الکل – استن )

این عامل دو عمل را انجام می دهد:

الف)حلال چربی است.

ب) دهیدراته کننده پروتئین ها است.

9-شستشو با آب

10-اضافه کردن رنگ سافرانین یا فوشین به مدت 30 تا 60 ثانیه

12-شستشو با آب

13- خشک کردن

در رنگ آمیزی گرم باکتری گرم مثبت به رنگ بنفش و باکتری گرم منفی به رنگ صورتی دیده می شود.

رنگ آمیزی منفی باکتری ها:

در این رنگ آمیزی باید از رنگ های اسیدی مانند مرکب چین یا هندی و یا نیگروزین استفاده کرد.رنگ های اسیدی با داشتن کروموژن با بار منفی قادر به نفوذ به درون سلول نمی باشد زیرا بار الکتریکی سطح سلول باکتری ها نیز منفی می باشد.بنابراین در این نوع رنگ آمیزی سلول های بدون رنگ باکتری در زمینه رنگی به سادگی قابل شناسایی است.

این نوع رنگ آمیزی بررسی باکتری هایی را که به سختی رنگ می گیرند را ممکن می سازد.در این روش عمل ثابت کردن گسترش توسط حرارت لازم نیست و سلولها در معرض اثرات خاص مواد شیمیایی و حرارت قرار نمی گیرند بنابراین اندازه و شکل سلول ها به صورت طبیعی مشاهده می شود.

[Matin H-d 18,145]

قسمت سوم :

مواد لازم و روش تهیه رنگ برای رنگ آمیزی منفی:

مرکب هندی یا چین,مرکب رسم پلیکان شماره 17 جهت آزمایش پیشنهاد می شود.به عنوان محافظ 3/0% تری کروزول به آن می افزاییم.

روش رنگ آمیزی :

در روش رنگ آمیزی با مرکب هندی,کپسول ذرات کلوئیدی کربن مرکب را جذب کرده و در نتیجه به صورت یک هاله شفاف اطراف میکروارگانیسم مشاهده می شود .این روش برای مشاهده کپسول پنومونیه توصیه می شود.

1- یک قطره رنگ نیگروزین یا مرکب هندی را در یکی از دو انتهای لام قرار دهید.

2- یک لوپ پر از باکتری های مورد نظر را در قطره رنگ وارد کنید و با فیلدوپلاتین رنگ و باکتری ها را با هم مخلوط کنید.

3- یک لام دیگر برداشته و روی قطره رنگ حاوی باکتری ها قرار داده و بوسیله آن گسترش را آماده کنید.

خشک کردن گسترش و میکروسکوپی آن.

تفسیر رنگ آمیزی :

در این رنگ آمیزی باکتری ها بیرنگ , شفاف و در زمینه ای سیاه رنگ مشاهده می شود.

 

مشاهده ساختمان های مختلف باکتری :

1)رنگ آمیزی کپسول:

کپسول یک لایه ژلاتینی خارجی است که از سلول ترشح شده و آن را احاطه کرده و به دیواره سلولی متصل است.تمامی میکروارگانیسم ها قادر به تولید کپسول نمی باشد .سلول هایی که کپسول ضخیم دارند عموما بیماریزا می باشند زیرا این ساختمان باکتری را در مقابل عمل فاگوسیتوز سلول های میزبان محافظت می کند.

مراحل رنگ آمیزی کپسول _ روش جینز (jins ) :

1-تهیه گسترش از باکتری کپسول دار مانند کلبسیلا پنومونیه (Klebsiella pneumoniae )

2-خشک کردن گسترش در مجاورت هوا

3-اضافه کردن رنگ کریستال ویوله 2% به مدت 1 دقیقه

4-بسرعت آن را با جریان ملایم آب بشویید.

5-افزودن اسید استیک 1-2 % به مدت 10 ثانیه

6-شستشو لام با جریان ملایم آب

7- خشک کردن

8-مشاهده میکروسکوپی

در این روش جسم رویشی باکتری به رنگ آبی و کپسول به رنگ صورتی کمرنگ دیده می شود.

توجه :

لازم به ذکر است که در رنگ آمیزی کپسول نیازی به مرحله فیکس کردن به وسیله حرارت نیست زیرا حرارت سبب کوچک شدن سلول و ایجاد هاله شفاف کاذب می شود که ممکن است با کپسول اشتباه شود.

2)رنگ آمیزی اسپور :

اسپور حالت مقاوم سلول رویشی باکتری است . بعضی از باکتری ها در شرایط نامساعد محیط قابلیت تشکیل سلول مقاوم از سلول رویشی را دارند که در این حالت چون در درون سلول رویشی تشکیل می شود به آن اندوسپور گفته می شود هنگامیکه این فرم از سلول خارج می گردد به آن اسپور گفته می شود .

اسپور به دلیل داشتن پوششهای غیر قابل نفوذ در برابر شرایط نامساعد همچون کمبود رطوبت و دما و نور,

امواج رادیویی , مواد شیمیایی, انجماد, خشکی مقاوم می باشد.

اسپور زایی یک مرحله زایشی در چرخه سلول باکتری به حساب نمی آید بلکه یک مرحله استراحت (کمون ) بوده که در آن متابولیسم سلول غیر فعال شده و شرایط نامساعد را تحمل می کند.در صورت مساعد شدن شرایط اسپور قادر است به فرم رویشی تبدیل شود که این عمل طی سه مرحله انجام می شود عبارتند از:

فعال شدن ,جوانه زدن,تبدیل اسپور به فرم رویشی

مراحل رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین:

1-انجام مراحل 1 تا 3

4-افزودن رنگ مالاشیت گرین به مدت 10-15 دقیقه همراه با حرارت

سه نکته باید توجه شود:

ü رنگ خشک نشود.

ü رنگ نجوشد.

ü در صورت تبخیر مرتبا رنگ اضافه شود.

5-شستشو با آب

6-افزودن رنگ زمینه (سافرانین ) به مدت 1 – 2دقیقه

در این مرحله سلول های رویشی رنگ قرمز به خود می گیرند و به رنگ قرمز – صورتی دیده می شوند ولی اسپورها سبز دیده می شوند.

7- شستشو با آب

8- خشک کردن

9-مشاهده میکروسکوپی