رفتن به مطلب
mani24

تشخیص مولکولی ویروس آنفلوآنزا

پست های پیشنهاد شده

مقدمه

 

بیماری های ویروسی به عنوان مهم ترین علل خسارات اقتصادی به صنعت پرورش طیور به شمار میروند. از بین آنها ، بیماری آنفلوانزا علاوه بر خسارت اقتصادی ، از نظر بهداشت انسانی نیز اهمیت دارد . اولین پاندمی انسانی توسط تحت تیپ (H1N1) درسال 1918 بیش از جمعیت انسانی را مبتلا کرد و میلیون های نفر را از بین برد . هر چند وقوع انسانی بیماری آنفلوانزای طیور ناشی از تحت تیپ (H5N1) در جنوب شرقی آسیا به ندرت باعث وقوع بیماری در انسان گردید ، با وجود این انتقال بیماری آنفلوانزای طیور تحت تیپ (H5N1) از انسان به انسان ، در موارد نادری به ثبت رسیده است .

 

 

 

برای وقوع پاندمی در انسان سه شرط لازم است ؛ ویروس جدیدی از آنفلوانزا ظهورمی نماید که مردم نسبت به آن ایمنی نداشته باشند ؛ توانایی انتقال به انسان و ایجاد بیماری را داشته باشد ؛ توانایی انتقال انسان به انسان را کسب نماید . در مورد تحت تیپ (H5N1) ، دو شرط اولیه برای ایجاد پاندمی فراهم شده است . در صورت تغییر مختصر در آن و ایجاد ویروس جدید و کسب توانایی انتقال از انسان به انسان پاندمی بروز می نماید. انتشار سریع آنفلوآنزای آسیایی سویه از سال 2003و ثبت مدارکی مبنی بر انتقال آن از گونه های طیور به انسان و سایر پستانداران توجه جهانی به سمت روشهای تشخیص ویروس آنفلوآنزا سوق پیدا نمود . همزمان با روشهای سنتی متداول تشخیص این ویروس ، تکنیک های جدید به وفوری جهت بررسی و تشخیص ویروس آنفلوآنزا در سراسر جهان به سرعت ابداع گردید . در این بین روشهای مولکولی پیشرفت قابل توجهی نمود و تکنیک های جامعی را بوجود آورد که با استفاده از آن می توان در یک روز علاوه بر تشخیص ویروس پاتوتیپ آن را تمیین نمود و نیز مشخصات فیلوژنتیکی ویروس A آنفلوآنزا جداسازی شده از نمونه های کلینیکی را مورد ارزیابی قرار داد.

تشخیص کلینیکی آنفلوآنزای طیور بسیار پیچیده می باشد زیرا این ویروس ضایعات پاتوگونومیک از لحاظ بالینی و میکروسکوپی ایجاد نمی کند . بخصوص در پرندگان آبزی که مخازن عمده این ویروس هستند عفونت بدون وجود علائم خاص می باشد . این پرندگان به عنوان حامل می توانند باعث دفع ویروس شوند که ضایعات شدیدی را در طیور اهلی ایجاد می نماید در طیور اهلی میزان ضایعات پاتولوژیک بر حسب تحت تیپ و پاتوتیپ ، گونه میزبان و حضور عفونت های ثانویه ، تفاوت می کند.

جمع آوری نمونه ها و ذخیره سازی

ویروسهای آنفلوانزای طیور عموماً از سوآپ های نای ، محوطه دهانی ، حلقی یا سوآپ های کلوآک از پرندگان زنده یا مرده جدا می گردد زیرا اغلب ویروسهای حاد و غیر حاد در مجاری تنفسی و گوارشی تکثیر می یابند . این سرآپ ها باید در یک محیط استریل که حاوی سطوح بالایی از آنتی بیوتیک برای جلوگیری از رشد باکتریایی است ، قرار داده شود. بافتها ، ترشحات یا مواد دفعی این مجاری برای جداسازی و تشخیص ویروس مناسب می باشند بافت ها را می توان در کیسه های پلاستیکی استریل قرار داد . در هنگام آزمایش بافت باید به این نکته دقت نمود که اندام های داخلی باید جدا از بافتهای مجاری تنفسی و گوارشی بررسی گردد زیرا جداسازی ویروس از اندام های داخلی عموماً نشاندهنده انتشار سیستمیک ویروس است و اغلب با ویروسهای حاد (HPAI) ارتباط دارد . در موارد HPAI تمام اندام ها به علت انتشار وسیع ویروسی ، حاوی ویروس هستند. اگر نمونه ها درعرض 48 ساعت قابل آزمایش هستند می توان آنها را در 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد ولی اگر بیش از این طول بکشد توصیه می شود که نمونه ها در نگهداری گردد . قبل از آزمایش ویروس شناسی بافت ها باید در یک محیط انتقالی به صورت سوسپانسیون 5 تا 10% درآمده و سپس با سرعت پایین سانتریفوژ گردد (Swayne and Hatvorson 2008).

1-مکانیسم های حدت ویروس

ویروس های آنفلوانزای طیور ممکن است بر اساس شدت نشانه های بالینی که در پرندگان حساس ایجاد می نمایند ، دسته بندی شوند.آنفلوانزای طیور با بیماری زایی کم ممکن است به وسیله 16 تیپ هماگلوتینین ایجاد شوند و در پرندگان حساس بیماری خفیف تولید نمایند ، که به وسیله ی نشانه های گوارشی ، تنفسی مشخص می شود و اغلب در مرغ های تخم گذار تجارتی و مرغ های مادر این نشانه ها با اختلالات تولید همراه است . گاهی ویروس های ( LPAI) اصطلاحاً ویروس های آنفلوانزای طیور با بیماری زایی ملایم (MPAI) نامیده می شوند . بر عکس ، آنفلوانزای طیور با بیماری زایی بالا یک بیماری عمومی ویروسی با تلفات بالا است که در بسیاری از پرندگان گالیناسه تلفات نزدیک به 100 درصد ایجاد می کند به هر حال ، این دو بیماری با یکدیگر ارتباط دارند. شواهد جمع آوری شده از موارد همه گیری های اخیر نشان داد که ویروس های (LPAI) تیپ های ( ) و ( ) ممکن است مدتی بعد از ورود به گله های طیور اهلی ، جهش یابند و تبدیل به (HPAI ) شوند ، علاوه بر این جهش ویروس های (LPAI) تحت تیپ ( ) به ویروس های (HPAI) در آزمایشگاه نیزایجاد شده است . نشانه های بالینی (HPAI) فقط به وسیله ی تحت تیپ های ( ) و ( ) که دارای اسیدهای آمینه بازی متعدد در محل شکاف مولکول پیش ساز هماگلوتینین باشند ، ایجاد می شود . شکاف مولکولی پیش ساز هماگلوتینین برای عفونی زایی ذرات ویروس آنفلوانزای طیور لازم و ضروری می باشد و تعداد اسیدهای آمینه بازی موجود در محل شکافتگی ، انواع آنزیم های

میزبانی موثر در این محل را تعیین می کند .در حقیقت وجود اسیدهای آمینه ی بازی متعدد اجازه می دهد که هماگلوتینین به وسیله ی پروتئازهای عمومی و فراوان موجود در بافت های میزبان شکافته شود . بنابراین ویروس در همه ی قسمت های بدن میزبان از جمله اندام های حیاتی تکثیر و منجر به مرگ پرنده می شود . برعکس ، ویروس های (LPAI) ، اسیدهای امینه بازی متعددی در محل شکافتگی هماگلوتینین ندارند و این ویژگی ، شکستن مولکول پیش ساز هماگلوتینین را محدود به آنزیم های شبه تریپسینی می کند. بنابراین ویروس های (LPAI) تنها در محل هایی که آنزیم های تریپسین و شبه تریپسین دارند ، یعنی در اپی تلیوم روده و بافت پوششی دستگه تنفس تکثیر می یابند .پرندگان آبزی از این فرضیه مستثنی هستند ، این پرندگان علاوه بر این که به عنوان منبع ویروس های (LPAI) عمل می کنند ، نسبت به ویروس (HPAI) مقاوم هستند و نشانه های بالینی را نشان نمی دهند(ترجمه میاحی وجعفری. 1386 ) .

روشهای تشخیص ویروس آنفلوآنزا

تکنیک های تشخیص مستقیم

جداسازی ویروس

اثبات وجود ویروس با تلقیح ویروس در تخم مرغ جنین دار به عنوان روش استاندارد طلایی تشخیص ویروس AI از نظر تاریخی شناخته شده است . ویروس به درون کیسه کوریو آلانتوئیک و در بعضی مواقع به داخل کیسه زرده و غشاء کوریو آلانتوئیک تلقیح می شود. سپس به مدت 24 تا 48 ساعت برای سویه های HPAI و حداکثر به مدت 21 روز با 2 یا 3 پاساژ برای بعضی از سویه های LPAI انکوبه می شوند (Chariton B, et al .,2008)

جنین ماکیان 11-9 روزه با 2/0 میلی لیتر از نمونه مشکوک به درون کیسه آلانتوئیک یا کیسه زرده تلقیح می شود . بعد از 72 ساعت (بسته به سویه ویروس ) تخم مرغ یا جنین مرده از آنکوباتور برداشته شده و مایع آلانتوئیک جمع آوری می شود . وجود ویروس بوسیله فعالیت هماگلوتینین اثبات می گردد. ولی باید حضور ویروس نیوکاسل را نیز مدنظر قرار داد . معمولاً اگر ویروس وجود داشته باشد در اولین پاساژ هماگلوتیناسیون رخ خواهد داد و نیاز به پاساژ مجدد نیست ((Swayne and Hatvorson 2008)

مایع آلانتوئیک از نظر وجود هماگلوتیناسیون برای شناسایی ویروس استفاده می شود . اما به این نکته باید توجه نمود که سایر ویروسهای دارای خاصیت هماگلوتینین مثل پارامیکسو ویروسها ممکن است باعث مثبت شده آزمایش گردند. بنابراین ابتدا باید ویروس با روش HI علیه ویروس نیوکاسل و سایر ویروسهای مشابه تست شود اگر منفی بود این ویروس باید از لحاظ وجود آنتی ژن اختصاصی تیپ A آنفلوآنزا مورد ارزیابی قرار گیرد . نوکلئوپروتئین اختصاص تیپ NP یا پروتئین ماتریکس (M) را می توان بوسیله ایمونودیفیوژن دو طرفه یا تثبیت Ag با روشهای ایمنی مورد آزمایش قرار داد( Swayne and Hatvorson 2008).

منوکلونال آنتی بادی که با نوکلئوپروتئین یا پروتئین ماتریکس واکنش نشان میدهد در روش الیزا برای این هدف بکار برده می شود .

مرحله بعد ، تشخیص تحت تیپ های آنتی ژن های سطحی HA و NA می باشد . تحت تیپ های NA بوسیله روشهای میکرو NI(Micro –NI assay) با آنتی سرم هایی که علیه 9 سویه شناخته شده NA تهیه شده ، شناسایی می گردد . آنتی ژن HA بوسیله آزمایش HIتشخیص داده می شود در این هدف بوسیله یک آنتی سرم پلی کلونال تهیه شده علیه تمام ویروسهایی که 16 تحت تیپ HA را بروز می دهند صورت می گیرد . شناسایی این تحت تیپ ها بوسیله بکاربردن آنتی سرم اختصاصی علیه یکایک HA به صورت مجزا صورت می گیرد . ظهورویروس آنفلوآنزا با HA جدید قابل شناسایی باتحت تیپ های HA شناخته شده نیست .بنابراین برای تایید عامل هماگلوتینین ناشناخته نیاز به آزمایش تشخیص اختصاص تیپ می باشد که قبلاً توضیح داده شد. تشخیص نهایی عمدتاً توسط آزمایش مرکزی فدرال یا آزمایشگاه رفرانس OIE آنفلوآنزا صورت می گیرد (( Swayne and Hatvorson 2008)

تسخیر Ag ویروسی در روش ELISA

روشهای الیزا که در آن Ag ویروس را جذب می کنند روشی جهانی برای تشخیص سریع آنفلوآنزا گروه A میباشد در این روشها ویروس آنفلوآنزا یا آنتی ژن های ویروسی با بکاربردن منوکلونال آنتی بادی اختصاص نوکلوپروتئین یا آنتی بادی پلی کلونال که در یک ماتریکس جامد باند شده است انجام می گیرد . سپس ویروس آنفلوآنزا A در نمونه های کلینیک ، سوآپ های کلواک یا بافتها توسط یک آنتی بادی ثانویه متصل شده به ماده رنگ زا مورد شناسایی قرار می گیرد .

همچنین تسخیر Ag ها در محل هماگلوتینین در تشخیص ویروس آنفلوآنزا H5 بکار گرفته شده است . این گونه روشهای الیزا از لحاظ تکنیکی ساده بوده و تنها چند دقیقه وقت برای آزمایش نیاز دارند اگر چه از یک سازنده تا سازندگان دیگر روش الیزا تفاوت هایی وجود دارد .

محدودیت تشخیص برای اکثر روشهای الیزای تجارتی ، 1000 برابر کمتر از جداسازی ویروس می باشد و به طور معمول نیاز به تا ذره ویروس برای شناسایی نیاز دارد . روشهای الیزا زمانی مناسب هستند که خطر بالایی از بروز عفونت فعال آنفلوآنزا وجود دارد و انتشار ویروس شدت بالایی داشته نیاز به آزمایشات تکمیلی باشد ولی در سطوح پایین انتشار ویروس و یا زمان کوتاه دفع ویروس درحدود2 تا 5 روز ، این نوع روشهای الیزا حساسیت لازم و قابل اعتماد جهت تشخیص شیوع بیماری را ندارند (Chariton B, et al .,2008) .

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

روشهای تشخیص مولکولی

 

 

 

تکنیکهای تشخیص غیر مستقیم

 

روشای تشخیص مرسوم مثل انتشار در ژل آگار و ممانعت از هماگلوتیناسیون به طور وسیعی در جهان جهت بررسی شیوع بیماری در گونه های طیور اهلی مورد استفاده قرار گرفته است . یک نوع روش الیزا درجهان به عنوان یک آزمایش خاص غیر وابسته به گونه های طیور ارائه گردیده است که این روش برای اردک ها ، غاز و دیگر پرندگان وحشی قابل استفاده می باشد در صورتیکه روش انتشار در ژل آگار به دلیل فقدان آنتی بادی های رسوب دهنده خیلی موثر نیستند در نتیجه آنتی بادی هایی که با روش های مرسوم قابل اندازه گیری نیستند با روش الیزا قابل ردیابی خواهند بود . روشهای دیگر الیزا که آنتی بادی ها را بر اساس گونه طیور مثل ماکیان و بوقلمون جستجو می کنند نیز به صورت تجارتی در دسترس می باشد(Chariton B, et al .,2008).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل(2)

 

 

 

 

 

 

 

روشهای تشخیص مولکولی :

 

رهیافت های تشخیص اسید نوکلئیک بویژه براساس PCR به طور گسترده ای در سالهای اخیر پیشرفت کرده است . روش RT-PCR و RT-PCR با زمان واقعی جهت تشخیص ویروس آنفلوآنزا ، همچنین برای تشخیص تحت تیپ ها بر اساس سکانس ژنتیکی درناحیه ژن های هماگلوتینین و ژن های نور آمیداز به طوروسیعی برای بررسی شیوع بیماری و نیز تشخیص بیماری استفاده می شود . روش PCR‍ دارای مزایایی از قبیل سرعت تشخیص درعرض چند ساعت و دارای قدرت آنالیز تشخیصی در حدود 5 تا 100 ذره ویروسی است .

 

روش MRT-PCR که به طورهمزمان 2 تا 3 هدف را جستجو می کند جهت تشخیص تفریقی قطعات ژنوی چند گانه بخصوص تحت تیپ های هماگلوتینین آنفلوانزا ارائه گردیده است درضمن این روش قادر به شناسایی عواملی است که از لحاظ کلنیکی علائم مشابه هم دارند . روش RRT-PCR که 3 ساعت به طول می کشدو دارای ویژگی و حساسیت بالاتری نسبت به جداسازی ویروس میباشد، جهت اهداف تشخیص و مانیتورینگ در سطح مزرعه بکار می رود . در ایالات متحده بررسی نمونه های نای و یا دهانی ، حلقی به وسیله RRT-PCR روی ژن های ماتریکسی انجام می شود و اگر مثبت بوداین نمونه ها با استفاده از RRT-PCR مخصوص تیپ های و مورد آزمایش قرار می گیرد( Swayne and Hatvorson 2008) .

 

آنالیز بر اساس سکانس ژن ها با بکار بردن روش استانداردسانجر یا روشهای دیگر در سالهای اخیر جهت تحقیقات اپیدمیولوژیک و تشخیص ویروس با تفکیک فیلوژنتیکی بسیار بالا مورد استفاده قرار گرفته است.

 

 

 

با توجه به تنوع روشهای مولکولی در تشخیص ویروس آنفلوانزای طیور، روش های مختلفی توسط محققین برجسته این رشته ارائه گردیده است که هر کدام از جنبه خاصی این موضوع را بررسی نموده اند جهت بررسی تلاشهای انجام شده ، مواردی از آخرین مقالات گزارش شده در این زمینه به صورت مختصر ارائه می گردد.

 

1- شناسایی و تعیین تحت تیپ های ویروس آنفلوانزای طیور بوسیله RT-PCR

پایه و اساس تفاوت های آنتی ژنی سرو تیپ های HA و NA به علت تفاوت در سکانس اسیدهای آمینه آنها است . Air در سال 1981 نشان داد که سروتیپ های مختلف HA ازلحاظ اسیدهای آمینه درحدود20تا74%متفاوت هستند درصورتیکه دریک سروتیپ HAاین تفاوت بین 0 تا 9% است . زیرا سکانس های اسیدهای آمینه بوسیله نوکلئوتیدها مشخص می شود و حالت wobble درکدن های استفاده شده وجود داردبنابراین تفاوت در سکانس نوکلئوتیدها در بین سروتیپ های HA باید بیشتر از 20تا74% باشد این موضوع پایه و اساس تعیین و سروتیپ های HA توسط RT-PCR را تشکیل می دهد .زیرا ویژگی PCR بوسیله تفاوت در سکانس های نوکلئوتیدی مشخص می گردد . گزارشی که در ذیل ملاحظه می شود روش تشخیص سریع ویروس آنفلوانزا بوسیله RT-PCR می باشد که درضمن توانایی تشخیص سروتیپ های HA را به صورت مستقیم از اندام ها دارد(lee et al,.2001 ) .

 

سویه های رفرانس استفاده شده و سویه های ویروسی که سکانس شده اند در جدول (1) نوشته شده است .

 

 

 

جداسازی RNA

 

RNAبابکار بردن معرف تریزول (Trizol) استخراج گردید . ml 1/0- از مایع آلانتوئیک یا اندام هموژن شده با ml 1 معرف تریزول مخلوط گردید . بعد از مخلوط کردن ، در دمای اتقاق به مدت 5 دقیقه نگهداری شد . مخلوط توسط 18/0 میلی لیتر کلروفرم – ایزوآمیل الکل (24:1) استخراج گردید . پس از سانتریفوژ 000/10 دور به مدت 15 دقیقه ، RNA موجود در محلول آبی توسط اضافه نمودن ایزوپروپانل به همان حجم اولیه ، ته نشین گردید. رسوب RNA با انجام سانتریفوژ 000/10 دور به مدت 20 دقیقه جمع آوری گردید سپس بوسیله اتانول 75% شسته و در 50 میلی لیتر از آب عاری از RNase حل گردید(lee et al,.2001 ) .

 

طراحی پرایمر

 

جهت شناسایی ویروس آنفلوانزای طیور بوسیله RT_PCR دو نوع پرایمر بر اساس سکانس های محافظت شده در ژن NP ویروس آنفلوانزای طیور ، انسان ، خوک و ا جدول(1):سویه های رفرانس آنفلوانزاکه دراین تحقیق بررسی شده اند

 

 

 

اسب طراحی گردید . سکانس های محافظت شده توسط مقایسه سکانس ها و ترتیب

 

سکانس ها از 100 سکانس NP بازیافت شده از GenBank (NCBI) انتخاب گردید پرایمرهای خاص NP که توسط این محققین طراحی گردیدند عبارتند از :

 

 

 

 

 

 

 

NP/200(for ward) 5 -CAG(A/G)TACTGGGC(A/T/C)

 

ATAAG(A/G)AC-3

 

NP(Reverse): 5 -GCATTGTCTCCGAAGAAAATAAG-3

 

جهت تعیین تحت تیپ های آنفلوانزای طیور 15 نوع پرایمر بر اساس سکانس حفاظت شده در هر تحت تیپ HA طراحی گردید. بیش از 1000 سکانس HA در بانک ژنی شامل همه تحت تیپ های HA ویروس طیور، انسان ، خوک و اسب جهت طراحی این پرایمر ها در نظر گرفته شدند، تعدادی از این سویه های در نظر گرفته شده جهت طراحی پرایمر درجدول (2) بیان گردیده است(lee et al,.2001 ) .

 

انجام آزمایش PCR:

 

آزمایش RT-PCR دریک مخلوط واکنش حاوی مواد ذیل انجام شد.

25 میکرو لیتر حاوی 5/2 میکرو لیتر بافر(پروسکا) و 5/2 میکرولیترdNTP

 

2/0 میکرولیتر AMV ترانس کریپتازمعکوس + 3/0 میکرولیتر مهارکننده RNase

 

5/0میکرولیتر DNA Taq پلی مر از و ا میکرولیتراز هر پرایمر و 1 میلرو لیتر RNA الگو و 17 میکرو لیتر آب

 

تکثیر توسط PCR برای NP ، در سانتی گراد به مدت 45 دقیقه، جهت ترانس کریپتاز معکوس به مدت 2 دقیقه ، 35 سیکل در به مدت 30 ثانیه جهت مرحله واسرشت درنظرگرفته شد.

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

به مدت 40 ثانیه جهت مرحله anneling و به مدت 40 ثانیه برای مرحله طویل شدن وسپس به مدت 10 ثانیه به منظور طویل شدن انتهایی ،برنامه PCR برای تکثیر همانند بالاست به جز اینکه دمای اتصال پرایمر به کاهش می یابد(lee et al,.2001 ) .

 

تعیین سکانس DNA

 

DNA تکثیر شده بوسیله کیت خالص سازی DNA , خالص سازی شده واین DNA از دو جهت توسط پرایمرهای یکسان توسط دستگاه سکانس کننده اتوماتیک تعیین سکانس شدند سکانس نوکلئوتیدی توسط برنامه sequman طراحی گردید . وسپس باسکانسهای موجوددربانک ژنی مقایسه گردید . (توسط برنامه بلاست در NCBI)

 

سکانس نوکلئوتیدی در ژن NP به میزان نسبتاً بالایی در همه تحت تیپ های آنفوانزای طیور حفاظت شده است لذا دو نوع پرایمر بر اساس این سکانس ها طراحی شد این دو نوع پرایمر قادر هستند که یک قطعه 330 bp را در همه ویروسهایی که در جدول 1 نگاشته شده اند را تکثیرنماید . تشخیص قطعه bp 330 با آنالیز و مقایسه سکانس ها توسط برنامه بلاست مورد تایید قرار گرفت 91 سویه توسط RT-PCR مورد آزمایش قرار گرفتند و درهمه آنها قطعه bp 330 جداسازی شد . بنابراین نتیجه می شود منطقه ای که برای طراحی پرایمرهای NP انتخاب شده کاملاً محافظت شده بوده و جهت تشخیص این ویروسهای می تواند مورد استفاده قرار گیرد . ویژگی پرایمرهای NP توسط RT-PCR با بکاربردن الگوی استخراج شده از ویروسهای دیگرطیور مثل نیوکاسل ، ویروس برونشیت عفونی و ویروس بورس عفونی و لارنکوتراکئیت عفونی مورد آزمایش قرار گرفت و هیچ کدام از این ویروسهابا PCR محصول فوق را نشان ندادند . این موضوع نشان می دهد که پرایمرهای NP فوق العاده ویژه جهت آنفلوانزای طیور می باشند . حساسیت RT-PCR با بکار بردن پرایمرهای NP توسط یک سری رقیق سازی متوالی RNA ویروس آنفلوانزای طیور از 1/0 نانوگرم تا 1/0 پیکو گرم بررسی گردیدکه در نتیجه حساسیت این تست بین 1 تا 1/0 پیکوگرم محاسبه ش(lee et al,.2001 ) د.

 

تشخیص تحت تیپ های ویروس آنفلوانزای طیور بوسیله RT-PCR

 

جهت طراحی پرایمرهای خاص هر یک از تحت تیپ های HA سکانس نوکلئوتیدی همه تحت تیپ های ژن HA بازیافت شده از بانک ژنی مورد بررسی قرار داده شد باتوجه به اینکه تحت تیپ های فقط یک یا دو سکانس نوکلئوتیدی کامل در بانک ژنی را داشتند ، این پژوهشگران 11 سویه اضافی را برای تحت تیپ های بالا نیز سکانس نمودند . سکانس ها در مناطقی که محافظت شده هستند در هر تحت تیپ جهت طراحی پرایمر انتخاب گردید . کل 15 سری پرایمر با این روش طراحی و در جدول (2) نگاشته شده است . پرایمرها مربوط به قسمت ژن هستند.

 

ویژگی این پرایمرها توسط RT-PCR با بکاربردن RNA الگوی جداشده از تمام 15 تحت تیپ HA مورد آزمایش قرار گرفتند . همانطور که در شکل (1) نشان داده شده است برای هر تحت تیپ HA به صورت انفرادی فقط یکی از 15 واکنش RT-PCR محصول مورد نظر با اندازه مشخص را ایجاد می نماید .

 

 

 

شکل(1):تشکیل باند های محصولاتPCRدر15تحت تیپ ویروس آنفلوانزا

 

 

 

 

 

اندازه محصول PCR از 231 bp تا bp 770 بسته به تحت تیپ HA می باشد . شناسایی این محصولات PCR بوسیله جستجوی بلاست با بکاربردن آنالیز سکانس ها و مقایسه آنها مورد تایید قرار گرفت . باجستجو دربلاست وقتی که سکانس نوکلئوتیدی محصول PCR با سکانس ژن HA از همان تحت تیپ HA مقایسه گردید ، تشابه سکانس بسیار بالایی در حدود 98تا100% نشان داد (lee et al,.2001 ) .

 

از کل 91 سویه جدا شده (80 سویه با منشاء طیور و 11 سویه با منشاء انسان ، خوک ، اسب) توسط RT-PCR تحت تیپ شده و نتایج آن با ازمایش HI، 100% مطابقت دارد که این نتایج در جدول (3) آورده شده است .

 

 

 

 

 

 

 

جدول(3):مقایسه نتایج تعیین تحت تیپ های ویروس آنفلوانزابه وسیله HIوRT_PCR

جهت بررسی این موضوع که آیا تکنیک RT-PCR می تواند جهت تشخیص و تعیین تحت تیپ ویروس آنفلوانزای طیور در اندام های هموژنیزه بکار رود این محققین 48 اندام هموژنیزه از 12 فارم متفاوت ماکیان را انتخاب نمودند از میان 48 بافت هموژنیزه فقط 3 مورد (2 مورد از مجرای تنفسی و یک مورد از طحال) توسط RT-PCR با بکاربردن پرایمراهای NP ویروس آنفلوانزا مثبت تشخیص داده شدند . جهت تعیین این 3 مورد ، تکنیک RT-PCR ابداع شده بکارگرفته شد وتمام نمونه ها مبتلا به سویه بودند .این تشخیص توسط روشهای رسمی و سرولوژیکی نیز مورد تایید قرار گرفت . این نتایج نشان می دهد که RT-PCR می تواند جهت شناسایی ویروس AI در اندام های هموژنیزه بدون نیاز به تکثیر ویروس در کشت سلول یا تخم مرغ جنین دارنیز انجام پذیرد(lee et al,.2001 )).

 

درمقایسه باسایر روشهای انجام شده مثل تشخیص ویروس A آنفلوانزا توسط

 

(chevianet et al, 1994, Atmar et al, 1996) یا تشخیص بین آنفلوانزای A،B،C (wright et al , 1995 . , zou et al 1997) ونیزتعیین تحت تیپ ویروس از و یا از گزارش گردیده است(Stockton et al 1998) . اما پژوهشگران حاضر توانستند سویه تا را تفریق نمایند .

 

مزیت روش RT-PCR علاوه بر کاهش زمان ، تعیین تحت تیپ و آنالیز سکانس ها و سپس مقایسه آنها ، آنالیز فیلوژنیک می باشد که می تواند اطلاعات مفیدی را در رابطه با منشأ ویروس ارائه دهد در صورتیکه این اطلاعات از طریق HI بدست نمی آید.

 

تکثیر موفقیت آمیز PCR بستگی به طراحی پرایمر خوب دارد . از لحاظ تئوری هر چقدر تعداد سکانس های بررسی شده بیشتر باشد احتال اینکه سکانس مورد نظر ، محافظت شده باشد بیشتر است ، به عنوان مثال برای تا و و حداقل 10 سکانس برای تعیین هر تحت تیپ درنظرگرفته شد ولی در مقابل ، ، ، فقط 1تا4 سکانس در بانک ژنی قابل دسترس بودجهت جبران این نقص اگر چه سویه های اضافی نیز بکار گرفته شد ولی با این حال در صورت گزارش سویه های بیشتر احتیاج به تجدید و تکمیل طراحی پرایمر می باشد (lee et al,.2001 )

 

این محققین به موازات تحقیق حاضر ، طراحی پرایمر بر اساس ژن های NA را نیز انجام دادند ولی به علت نبودن سکانس کامل - در بانک ژنی قادر به طراحی مناسب پرایمرها نشدند.

 

نتیجه دیگری که از این تحقیق بدست آمد شناسایی تحت تیپ در تایوان و خطر شیوع اندمیک سویه در این کشور می باشد (Chariton B, et al .,2008) .

 

2- تشخیص تحت تیپ های ، و ویروس آنفلوانزا بوسیله MRT-PCR)

 

به منظور تشخیص تحت تیپ های ، و به صورت همزمان ، آزمایش MRT-PCR ابداع گردید((Chaharaein et al.,2009.

 

طراحی پرایمر : سکانس نوکلئوتیدی AIV برای ژن های NP، ، ، و از بانک ژنی NCBI بازیافت و توسط نرم افزار Megalign بررسی گردید . چهار الگوی پرایمراختصاصی ژن های فوق با بررسی بیش از 300 سکانس محافظت شده ژن ها ، طراحی گردید .

 

 

آزمایش RT-PCR

 

یک لوله جهت RT-PCR حاوی پرایمرهای NP، ، ، و 100 نانوگرم RNA ویروسی به صورت جداگانه توسط روش RT-PCR پرومگا در 50 میکرولیتر محلول که توسط chaharaein در سال 2006 توصیف شده است بکارگرفته شد. نمونه ها تحت شرایط زیر تکثیر شدند :

RT در به مدت 45 دقیقه

یک سیکل در به مدت 2 دقیقه

40 سیکل در دمای به مدت 20 ثانیه

اتصال پرایمر (anneling)

برای NP 1دقیقه

برای 1دقیقه

برای 1دقیقه

برای 1دقیقه

مرحله طویل شدن به مدت 1 دقیقه .

مرحله طویل شدن نهایی به مدت 7 دقیقه .

به منظور تعیین حداقل زمان برای تشخیص تحت تیپ های AIV توسط RT-PCR برنامه ذیل اجرا گردید :

واکنش RT برای سنتز اولین CDNA در دمای به مدت 40،30،20،10 دقیقه انجام شد سپس 40،30،25،15 سیکل تکثیر PCR اجرا گردید . با بکاربردن پرایمرهای اختصاصی حداقل زمان لازم جهت تشکیل CDNA ، 30 دقیقه در 25 سیکل بدست آمد محصول PCR در 10 و 20 دقیقه و یا 15 سیکل بدست نمی آید .

جدول (4) :الگوی پرایمرها جهت تکثیر NP و تحت تیپ های ، و

ویروس آنفلوانزا پرایمرهای اختصاص تیپ، یک قطعه ای به طول 106 pb از NP ویروسهای مختلف ، و را تکثیر نمودند. هیچ محصولی ناشی از تکثیر PCR با بکاربردن ویروسهای دیگری مثل NDV و IBDV مشاهده نگردید . پرایمرهای خاص تحت تیپ هر کدام یک قطعه خاصی از HA در اندازه های 499،409و231 pb از ویروس ، و را به ترتیب تکثیر نمودند .

شکل (2):تشکیل باندهای ناشی ازتکثیر محصولات ژنNP_H5 _- H7 - H9

در این روش هیچ گونه اتصال اشتباه پرایمرها با یکدیگر مشاهده نگردید و ویژگی محصول بدست آمده از MRT-PCR توسط آنالیز تعیین سکانس مورد تایید قرار گرفت .پرایمرهای طراحی شده ژن های ، و در حالت تنهایی و نیر در واکنش مخلوط وقتی با دقت 100و 10 نانوگرم هستند تکثیر می یابند اما اگررقت RNA ویروس ، به یک نانوگرم برسد هیچگونه محصول PCR تولید نمی گردد. با روش مذکور MRT-PCR وقتی که سوآپ نای بکار گرفته می شود . در 3 و 5 روز پس از عفونت واکنش MRT-PCR مثبت می شود ولی وقتی در روز 7 نمونه گیری انجام شد فقط 1 مورد از 10 نمونه مثبت جواب داد. در حالیکه با روش جداسازی ویروس (مشابه شرایط قبل) 6 مورد مثبت شناسایی شد. به طورکلی این محققین تاکید نمودند که پرایمرهای طراحی شده دارای حساسیت مشابه جداسازی ویروس هستند و همچنین حساسیت MRT-PCR نسبت به RT-PCR مرسوم تحت تاثیر غلظت RNA الگو قرار نمی گیرد وژن های مورد نظر با اندازه مشخص با موفقیت تکثیر می یابند ، زیرا قبلاً نشان داده شده بود که MRT-PCR در مقایسه با RT-PCR منفرد دارای حساسیت پایینی است((Chaharaein et al.,2009. .

3- تشخیص ژنتیکی تحت تیپ های ویروس A آنفلوانزا با روش RT-PCR از طریق بکاربردن یک پرایمر منفرد بر اساس سکانس حفاظت شده در منطقه کد کننده ژن

هدف از این تحقیق ،شناسایی و ابداع یک روش حساس و سریع برای شناسایی همه تحت تیپ های HA ویروسهای گروه A آنفلوانزا با بکاربردن فقط یک جفت پرایمر می باشد .

این روش با بکاربردن 12 سویه استاندارد شناخته شده از طیور ، خوک و انسان که تحت تیپ HA را نشان می دادند و سپس یک مطالعه کور با بکاربردن 30 سویه ویروسی که از لحاظ فنوتیپی همه تحت تیپ های HA را دارا بودند مورد بررسی قرار گرفت ( Phipps et al. , 2004) .

با توجه به مقالات چاپ شده در مورد ترتیب سکانس های در تحت تیپ های آنفلوانزا A، نشان داد که هفت تحت تیپ ( ، ، ، ، و ، ) تشابه زیادی در وضعیت 1156- 1134 ژن HA مشاهده می گردد و بر این اساس پرایمر جلویی باسکانس

HA-1134-F 5-GGA ATG ATH GAY GGN TGG TAT GG-3

( به انضمام کد گروه IUB استاندارد جهت افزایش ) و پرایمر معکوس BM-NS-890 R توصیه شده توسط(Haftman وهمکاران درسال 2001) انتخاب گردید . این پرایمر جهت تکثیر یک قطعه ژن HA به اندازهpb 640 استفاده گردید. تکثیر با روش RT-PCR با موفقیت ژن HA را انجام داد و سپس آنالیز سکانس محصول بوسیله Blast بالاترین تشابه را با همان تحت تیپ HA تایید نمود.

پرایمر جلویی HA-1134 F که برای تکثیر ژن انتخاب شده است ، دارای محافظت و ثبات بالایی در میان ویروسهای گروه A آنفلوانزا است و باعث می شود که این روش علی رغم تنوع وسیع ویروسها به عنوان یک روش کاربردی مطرح شود که در آن همه ویروسها با منشاء مختلف از جمله طیور ، خوک و انسان در مکان و زمان متفاوت تحت شناسایی قرار گیرند ( Phipps et al. , 2004) .

اگر چه در زمان طراحی پرایمر مستقیم جهت این هدف ، هیچ تحت تیپ جهت مقایسه ژن HA در این تحقیق انتخاب نشدلیکن به این نکته باید توجه شود که بعضی از سکانس های دارای یک جانشینی در نوکلئوتید T-C درمحل باز 21 در سکانس پرایمر HA-1134 F هستند . بنابراین این امکان وجود دارد که حتی در منطقه محافظت شده 1156- 1134 ممکن است تغییرات بیشتری نسبت به آن چیزی که قبلاً فکر می شد وجود داشته باشد که این امر سبب ایجاد حالت degeneracies در سکانس پرایمرها می شود . (Hoffman et al ,2001) روش RT-PCR در مرحله ای با پرایمرهای universal را طراحی نمود که قادر است تمام طول 8 قطعه ویروس آنفلوانزا را تکثیر نماید . در این مورد طراحی پرایمر بر این اساس استوار بود که سکانس نوکلئوتیدی انتهایی محافظت شده در و انتهای RNA ژنومی ویروس A آنفلوانزا برای هر قطعه منحصر به فرد می باشد . با بکاربردن پرایمرهای Bm-Hn-1 و Bm-Ns-890 ، نویسنده فوق توانست تمام طول HA به اندازه pb 1800 را در 8 تحت تیپ ویروس ( ، ، ، ، ، ، ، ( ایجاد نماید . لیکن این روش PCR با تمام تحت تیپ های ویروس نتایج متناقض ایجاد می کند.

lee وهمکاران درسال 2001 روشی از PCR جهت شناسایی کل 15 تحت تیپ ویروس آنفلوانزا را بر اساس ژن های گزارش نمود ولی این روش احتیاج به پرایمرهای اختصاصی برای هر تحت تیپ دارد . مزیت تحقیق حاضر به این علت است که با بکاربردن یک پرایمر منفرد ، به صورت سریع و دقیق تمام ویروسهای تحت تیپ HA را شناسایی می نماید ( Phipps et al. , 2004) .

4- شناسایی مولکولی و سریع تحت تیپ های ویروس A آنفلوانزا با استفاده از RT-PCR از ژن های نورآمیداز ویروسی

تا امروز مطالعات زیادی روی شناسایی تحت تیپ های HA ویروس صورت گرفته است لیکن تحقیقات کمی روی شناسایی تحت تیپ های نورآمیداز ویروس انجام شده است به جز مواردی که روی تحت تیپ های و صورت گرفته است و بیشتر به موارد انسانی ارتباط دارد ( wright et al., 1995) و اخیراً نیزیک جفت پرایمر با degenerate بالا جهت تکثیر یک قطعه ژن NA موجود در همه 9 تحت تیپ ویروسی گزارش شده است (Alvarez et al., 2008). لذا در این تحقیق روشی ابداع گردید و مورد ارزشیابی قرار گرفت که با استفاده از RT-PCR اختصاصی هر تحت تیپ قادر به تعیین و شناسایی کل 9 تحت تیپ نورآمیداز ویروس می باشد(Fereidouni et al., 2009 ) .

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

Join the conversation

You can post now and register later. If you have an account, sign in now to post with your account.

مهمان
ارسال پاسخ به این موضوع ...

×   شما در حال چسباندن محتوایی با قالب بندی هستید.   حذف قالب بندی

  تنها استفاده از ۷۵ اموجی مجاز می باشد.

×   لینک شما به صورت اتوماتیک جای گذاری شد.   نمایش به عنوان یک لینک به جای

×   محتوای قبلی شما بازگردانی شد.   پاک کردن محتوای ویرایشگر

×   شما مستقیما نمی توانید تصویر خود را قرار دهید. یا آن را اینجا بارگذاری کنید یا از یک URL قرار دهید.


×
×
  • جدید...