واکنش زنچیره پلیمراز pcr

[sa-ed 85]

تاریخچه PCR

سالهاپیش در سال ۱۹۷۱ ، Khorana و همکارانش روشی را برای همانند سازی از یکناحیه از DNA دو رشته ای را با استفاده از دو پرایمر ساخت DNA گزارش کردندکه انتهای ’۳پرایمر به سمت یکدیگر طراحی شده بود . ولی ایده استفاده ازاین خاصیت به صورت چرخه های تکراری در یک واکنش تکثیر تا ۱۲ سال بعد ارائهنشد. ” گاهی یک ایده خوب زمانی به ذهن شما میرسد که انتظارش را نداریم ”این جمله آغازین گزارش karry Mullis ، مخترع PCR در مجله ScientificAmerican است. در مورد اینکه چگونه در هنگام رانندگی درشب در کوههایکارولینای شمالی در بهار ۱۹۸۳ ایده راه اندازی PCR به ذهن وی الهام شد.

polymerase chain reaction یا PCR دستگاه فتوکپی DNA نامیده شده است.اگرچه PCR به نظر ساده می آید ، ولی در واقع یک فرایند پیچیده است که موادمختلفی در آن نقش دارند. بعضی از مواد در ابتدای واکنش غلظت بسیار کمیدارند (DNA الگو) ولی با پیشرفت واکنش غلظت آنها افزایش می یابد، ولی غلظتبرخی از آنها در طول واکنش به میزان بسیار جزئی تغییر می کند (پرایمر وdNTP ) .تغییرات دما و pH زیاد است ،به همین دلیل نوسانات زیادی درواکنشهای دینامیک مولکولی وجود دارد.بنابراین PCR یک فرایند بسیار پیچیدهاست . ولی کارایی و انعطاف پذیری آن برای کار بر روی DNA بسیار زیاداست.در زمان کوتاهی پس از اختراع آن توسط Kary Mumis ، PCR شناخت ما اززیست شناسی مولکولی را متحول کرده است.ورود PCR در تحقیقات زیست شناسی وپزشکی مثابه یک تقویت کننده در موتور عمل کرده و سرعت پیشرفت تحقیقات برروی ژنها و ژنومها را افزایش داده است . اکنون ما قادریم که تقریباً هرژنی را از هر موجودی با PCR جدا کنیم و این روش سنگ بنای تمامی پروژه هایتعیین توالی ژنوم می باشد . پس از جدا نمودن یک ژن می توانیم آن را بهمنظور کلون کردن و یا جهش زائی تغییر دهیم و یا اینکه روشهای تشخیصی برایشناسایی جهشهای آن ژن طراحی کنیم.

 

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) PROCESS

PCR یک فرایند آنزیمی در ناحیه مشخصی ار DNA می باشد که بارها و بارهاتکرار شده و مقدار بسیار زیادی کپی (محصول) از آن ناحیه مشخص را تولیدمیکند.

PCR با استفاده از اجزای همانند سازی طبیعی DNA ، در داخل لوله آزمایش DNAرا تکثیر می کند. در داخل یک سلول زنده فرایند همانند سازی ژنوم در یکفرایند بسیار پیچیده با دخالت چندین پروتئین مختلف صورت می گیرد. در سادهترین تعریف برای مراحل همانند سازی ، DNA دو رشته ای از هم باز شده و هررشته از مولکول اولیه برای ساخت یک رشته مکمل جدید استفاده می شود اینمراحل تکثیر بر توانایی نوکلئوتیدها برای جفت شدن با باز مقابل خود براساس قوانین معروف واتسون و کریک استوار است ( Aبا T و C با G ) بنابراینرشته الگو همیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.PCR فقط اجزاءاولیه این سیستم پیچیده همانند سازی را جهت تکثیر قطعات کو چک DNA در یکلوله آزمایش به کار می برد.در یک سیستم بافری ساده ناحیه خاصی از مولکولDNA الگو بوسیله یک DNA پلیمراز تکثیر می شود و دی اکسی نوکلئوتیدهابعنوان بلوکهای ساختمانی جهت تولید رشته جدید مورد استفاده قرار میگیرند.پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی اختصاصی که بر اساس قوانین کلی جفت شدنبازها به DNA الگو متصل می شوند ناحیه مورد نظر از DNA الگو را جهت تکثیرمشخص می کنند.رشته DNA الگو با استفده از حرارت از هم جدا میشوند ، حرارتباعث میشود که پیوندهای هیدروژنی بین بازهای رشته های DNA شکسته شود ، کهاین فرایند تقلیب (Denaturation) نامیده می شود.پرایمر هایاولیگونوکلئوتیدی توالیهای مکمل خود را بر روی DNA الگو پیدا خواهند کرد(اتصال annealing) و نهایتاً DNA پلیمراز اضافه کردن دی اکسی نوکلئوتیدهارا بر روی عامل ‘OH-3پرایمرها آغاز مینماید و مولکولهای جدید از روی هر دورشته تشکیل میشوند.در مرحله حرارت دهی بعدی این رشته های تازه ساز مجدداًاز هم جدا شده و تمامی رشته های جدا شده (هم رشته های اولیه و هم رشته هایتازه ساز) جایگاههای اتصال برای پرایمرها فراهم می آورند و بهنوان الگوبرای ساخت رشته های DNA بعدی عمل می کنند. و این افزایش مقدار محصول بهصورت تصاعدی صورت می گیرد در واقع تعداد رشته های توالی هدف در هر چرخهPCR دو برابر خواهد شد .

یعنی در صورت کارایی ۱۰۰% از هر نسخه DNA موجود درابتدای واکنش ، تنها پس از ۲۰ چرخه از PCR تعداد ۱۰

^۶

نسخهمحصول ساخته خواهد شد . البته کارایی واکنش هیچگاه ۱۰۰% نخواهد بود و اغلببه تعداد چرخه های بیشتر بین ۴۰-۲۵ چرخه نیاز می باشد که به مقدار DNAالگوی اولیه و هدف واکنش بستگی دارد . معنی این تکثیر تصادعی این است کهاگر واکنش شما بطور اتفاقی با مقادیر بسیار کم از DNA الگو آلوده شود ،ممکن است جوابهای اشتباه بدست آورید.

[sa-ed 85]

کاربردهای PCR

1- تشخیص بیماریها: از روش PCR برای بررسی بسیاری از بیماریها استفادهمیشود. مثلا در تشخیص بدخیمی هایی نظیر لوسمی (leukemia) و لنفوم(lymphomas)، سنجش PCR مستقیما بر روی DNAی ژنومی انجام میشود تا تغییر دربیان ژنها بررسی گردد. حساسیت این روش ده هزار برابر روشهای معمول است.PCR را میتوان بمنظور شناسائی میکروارگانیسمهایی بکار برد که قابل کشتنیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است از جمله میکوباکتریها(mycobacteria)، باکتریهای غیر هوازی (anaerobic bacteria) و ویروسها(viruses). در مطالعات میکروبیولوژی از روش PCR برای شناسائی عوامل عفونتزا و تشخیص گونه های پاتوژن از غیر پاتوژن نیز استفاده میشود. بدین منظورژنهای خاصی رهگیری و تعیین مقدار میشوند. بدلیل حساسیت بالای PCR، میتوانبلافاصله پس از عفونت و قبل از ظهور بیماری، وجود میکروارگانیسمها رابررسی و اقدامات درمانی را آغاز کرد.

2- تحقیقات جنایی (forensic analysis): در صحنه جرم، معمولا مقدار DNAبسیار کم است. بنابر این با روش PCR میتوان تکثیر DNA را انجام داد تامقادیر کافی از مولکولهای ژنتیکی بدست آید. سپس ماهیت DNA بررسی میشود.

3- انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting): با روش PCR میتوان باتوجه به ماهیت DNA به هویت اشخاص پی برد. بعنوان مثال والدین را شناسائیکرد و یا رابطه ژنتیکی افراد را بررسی نمود. همچنین رابطه تکاملی موجوداتزنده نیز با روش انگشت نگاری ژنتیکی قابل مطالعه است.

4- بررسی DNA قدیمی (ancient DNA): با روش PCR، مولکولهای DNA بسیار قدیمیحتی متعلق به ده ها هزار سال قبل مورد مطالعه قرار گرفته است. مثلا DNA یکماموت از چهل هزار سال قبل، مومیایی های مصری و تزار روسیه با این تکنیکبررسی شده است.

5- جداسازی DNAی ژنومی: با روش PCR میتوان بخشهایی از DNAی ژنومی راانتخاب و پس از جداسازی تکثیر نمود. مثلا برای کلونینگ DNA و یا تولیدشاخصهای دورگه سازی (hybridization probes) در روشهای Southern وNorthern، مقادیر زیادی از DNA مورد نیاز است که با روش PCR قابل تهیهاست. همجنین در مواردی که حجم نمونه اولیه بسیار کم باشد، با روش PCRمیتوان DNAی موجود را تکثیر کرد و سپس مورد مطالعه قرار داد.

6- تعیین توالی DNA (DNA sequencing): پس از تکثیر DNA با روش PCR، میتوانتوالی نوکلئوتیدی را تععیین کرد و در صورت لزوم به پلاسمید باکتری یا DNAیکروموزومی در یوکاریوتها الحاق نمود و بدین ترتیب DNAی نوترکیب(recombinant DNA) ایجاد کرد. حتی در مرحله بعد میتوان سریعا با استفادهاز PCR، کلنی های باکتری را از نظر وجود این DNAی نوترکیب مورد بررسی قرارداد.

 

PCR از طریق سرد و گرم کردن کنترل می شود

اساس PCR استفاده ازدماهای مختلف در سه مرحله واکنش ، تقلیب (denaturation) ، اتصال(annealing) و طویل شدن (extension) میباشد . یک دمای بالا معمولاً ۹۵-۹۴درجه سانتیگراد برای جدا شدن رشته های DNA الگو بکار برده می شود. سپس دماجهت اتصال پرایمرها به توالی مکمل بر روی رشته الگو پایین آورده می شود کهاین دما بستگی به پرایمرهای مورد استفاده دارد.نهایتاً برای ساخت DNA باکارایی زیاد ، دما در حد دمای بهینه فعالیت DNA پلیمراز تنظیم می شود .جهت تکثیر DNA هدف لازم است که این دما ، طی چندین چرخه (۴۰-۲۵ چرخه بستهبه کاربرد) تکرار شوند. این کار توسط دستگاه ترموسایکلر صورتمیگیرد.ترموسایکلر یک دستگاه قابل برنامه ریزی است که میتواند دما را بهسرعت تغییر دهد و لوله های آزمایش را در دمای مورد نظر با مدت زمان مشخصنگهداری نماید.قبل از اختراع این دستگاه از سه حمام آب گرم استفاده میشدکه هر کدام در یک دمای خاص تنظیم شده بود و لوله های آزمایش در بین حمامهابا دست جابجا می شد.

 

[sa-ed 85]

ترکیبات واکنش PCR

 

در یک واکنش PCR باید از DNA الگو، آنزیم Taq polymerase ، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها و آب استفاده شود.

DNA الگو

تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. نمونه های متنوعی از DNA و RNAبعنوان الگوی PCR قابل استفاده است . این نمونه ها شامل DNA های ژنومی ، mRNA ،c DNA ، خزانه های ژنی ، پلازمید ، فاژ، کاسمید ، و کلونهای BAC ،YAC میباشد . مقدار الگوی مورد نیاز معمولاً از طریق بهینه سازی بدست میآید ولی بطور کلی کمتر از یک نانوگرم از الگوی کلون شده و تا یک میکروگرماز DNA ژنومی استفاده میشود. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیراختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNAنیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیتنمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده درمرحله استخراج DNA مثل پروتئینها ، چربی ها ، فنل و EDTA، باعث اختلال درعملکرد وهمچنین کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه موردنظر می گردد.آنزیم Taq polymerase

این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرفترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد.دمای بهینه برای فعالیت این آنزیمدر حدود ۷۵-۷۲ درجه سانتیگراد میباشد . با استفاده از این آنزیم میتوان ازدماهای بالاتر از ۷۲ درجه نیز در مرحله اتصال پرایمر استفاده نمود که اینمزیت باعث دقت بیشتر در شناسایی توالی هدف توسط پرایمرها میگردد و توالیهدف بطور اختصاصی تکثیر می یابد. این آنزیم دارای وزن مولکولی ۹۴کیلودالتون میباشد که دارای دو خاصیت آنزیمی ’۳ به سمت ’۵ ، DNA پلیمرازیو همچنین فعالیت’۵ به سمت ’۳ اگزونوکلئازی است. این آنزیم دارای طول عمر۴۰ دقیقه در دمای ۹۵ درجه میباشد که معادل ۵۰ چرخه تحت شرایط عادی PCRاست.این آنزیم دارای فعالیت تصحیح اشتباه (proof reading) نیست.به طورمعمول حدود یک واحد از این آنزیم در ۵۰ میکرو لیتر از واکنش PCR استفادهمی شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده (PCR Inhibitor) باشد، میتوان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیمباعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. گرچه دمای مناسب برای این آنزیم۷۲ درجه سانتی گراد می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر بهفعالیت و تکثیر میباشد لذا برای جلوگیری از اتصال پرایمرها به نقاط دیگریروی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود کهتمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.نوکلئوتیدها

چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که بهعنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند.غلظت مورد نیاز ازهر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر۲۰۰-۵۰ میکرو مولار می باشد. اگر غلظت بالاتر از این حد باشد ، دقت واکنشدر جهت عکس کاهش پیدا میکند زیرا در این حالت DNA پلیمراز بازهای اشتباهرا در وارد زنجیره میکندو اگر غلظت پایینتر باشد ممکن است بر روی بازدهواکنش تاثیر داشته باشد.دستورالعمل ها غلظت ۲۰۰ میکرو مولار از هر یک از dNTP ها را توصیه میکند که این مقذار برای ساخت ۱۰ میکروگرم محصول کافیاست.