رفتن به مطلب

پست های پیشنهاد شده

كشت سلول و بافت گياهي كه با عنوانهاي كشت اين ويترو و يا كشت استريل نيز مطرح مي شود، ابزاري مهم در مطالعات پايه و كاربردهاي تجاري است. در حال حاضر به عملياتي نظير كشت سلولها، بافت ها و اندام هاي استريل و اجزاي آنها تحت شرايط مطلوب فيزيكي و شيميايي در آزمايشگاه، "كشت بافت گياهي" اطلاق مي شود.

استفاده از فن آوري كشت بافت براي تكثير رويشي گياهان يا ريزازديادي مهمترين كاربرد تجاري اين فناوري است. با اين فن آوري مي توان از يك گياه ميليونها گياه جديد، با كيفيت خوب و در زمان كوتاه توليد كرد. كشت بافت سلولي با ارائه تئوري سلولي در قرن 19 آغاز گرديد. اين تئوري عنوان مي كند كه سلول واحد ساختماني مستقل و عملي يك موجود است. كاربرد تجاري كشت بافت در سال 1960 در آمريكا با ريزازديادي اركيده آغاز شد.

 

 

 

 

Phalaenopsis%20seedlings%20in%20tissue%20culture%20at%20Taiwan%20Sugar%20Co..JPG

 

 

به طور كلي امتيازهاي روش ريزازديادي را مي توان در موارد زير خلاصه كرد:

1- ياهان تكثير شده به روش كشت بافت از قدرت رشد بالايي نسبت به گياهاني كه به روش هاي سنتي تكثير مي شوند برخوردارند.

2- ازدياد آن گروه از گياهاني كه با روش هاي سنتي به سختي تكثير شده و يا از نظر اقتصادي مقرون به صرفه نيستند.

3- تكثير و توليد تعداد زيادي از كلون هاي با ژنتيك معين.

4- بذور از ريسك كمتري براي جوانه زدن برخوردارند.

5- آزاد شدن از قيود اقليمي موجود از نظر فصل و زيستگاه و در تمام طول سال مي توان گياه توليد كرد.

6- حمل و نقل مواد گياهي را راحت تر مي كند.

7- نگهداري دراز مدت و ميان مواد گياهي.

8- تكنيك هاي كشت بافت در توليد گياهان عاري از ويروس، دستكاري ژنتيكي، هيبريداسيون سوماتيكي، اصلاح نباتات و مطالعات پايه استفاده مي شوند.

 

 

 

orchidSell050.JPG

 

 

 

 

 

prss.jpg

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

[h=2]دستور العمل کاربردی کشت سلول و بافت گیاهی[/h]

مقدمه

وقتی درباره کشت گیاه صحبت می شود معمولاً منظور کشت گیاهان در گلدان، زیرپلاستیک، گلخانه و یا مزرعه می باشد.

تکثیر رویشی که شامل قلمه زدن، خوابانیدن و پیوند زدن می باشد از دیرباز در کشاورزی اهمیت داشته و از آن در تکثیر گیاهان زراعی، درختان میوه و ... استفاده می شود. البته روشهای تکثیر رویشی در شرایط طبیعی در برخی موارد کارآمد نبوده و روش جدیدی از کشت گیاهان، تحت عنوان کشت سلول و بافت گیاهی معرفی و ارائه شده است.

کشت سلول و بافت گیاهی که با عنوان کشت درون شیشه (invitro ) و یا کشت استریل نیز مطرح می شود و در مورد تمام انواع کشتهای استریل که در شرایط درون شیشه ای انجام می گیرد ، به کار می رود.

در حال حاضر تکنیکهای کشت بافت به عنوان ابزاری قوی جهت مطالعه مشکلات اساسی و کاربردی بیولژی گیاهی در آمده است. علاوه برآن در سالهای اخیر این تکنیک ها کاربردهای تجاری گسترده ای در تکثیر گیاهان مختلف از جمله گیاهان زینتی و دارویی و نیز حذف عوامل بیماریزا از گیاهان پیدا نموده است.

علاقه مندی به کشت بافت و توانایی آن در اصلاح گیاهان به صورت یک موضوع جهانی درآمده است و افزایش تعداد کشورهای عضو شرکت کننده در موسسه بین المللی کشت بافت گیاهی گواهی براین ادعا می باشد . علاوه بر آن هیئت بیولوژی گیاهی موسسه تحقیقات سلولی یونسکو (ICRO) ، آموزش تکنیک های کشت بافت گیاهی را به عنوان یکی از برنامه های اولویت دار خود معرفی کرده است و تدریس تکنیکهای کشت بافت جزو برنامه درسی دانشجویان رشته های داروسازی ، پزشکی، کشاورزی، گیاهشناسی، زیست شناسی، جنگلداری و. .... درآمده است.

 

تاریخچه

اولین بار در سال 1838 اشلیدن و شوان تئوری Totipotency را ارائه نمودند. براساس این تئوری ، هر یک از سلولهای یک موجود پرسلولی اگر در شرایط مطلوب محیطی قرار بگیرند توانائی تکامل و تبدیل شدن به یک موجود کامل را دارند. بعدها این تئوری به عنوان اساس مطالعات در زمینه کشت بافت قرار گرفت.

اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط هابرلنت فیزیولژیست شهیر آلمانی در سال 1902 پیشنهاد گردید. وی اظهار داشت طبق مطالعاتی که اینجانب انجام داده ام، مطالعه سیستماتیک سازمان یافته ای روی کشت سلولهای رویشی ایزوله شده گیاهان عالی انجام نشده است. او بر روی سلولهای ایزوله فتوسنتزی برگ و سلولهای متفاوت دیگر آزمایش کرد که ناموفق بود. با این وجود اظهار داشت که می توان به طور موفق جنین های مصنوعی حاصل از سلولهای رویشی را کشت کرد. بنابراین او به طور واضح نظریه توتی پتانسی را بیان نمود و نشان داد که تکنیک کشت سلولهای ایزوله گیاهی در محلول غذایی، روش آزمایشی جدیدی برای بررسی مسائل مهم است. براساس تحقیقات او در سال 1902 (و بعد از آن) ، هابرلنت به عنوان پدر کشت بافت گیاهی نام گرفت.

پس از آن در سال 1907 اولین کشت سلولهای حیوانی و انسانی انجام شد اما در کشت سلولهای گیاهی پیشرفتی وجود نداشت تا اینکه در سال 1955 هورمون کینتین کشف شد و به دنبال این کشف، کشت سلولها و بافتهای گیاهی رونق گرفت به طوری که در سال 1958 تعداد آزمایشگاههای کشت بافت گیاهی در آمریکا و کانادا به بیش از 250 رسید که در هر آزمایشگاه سالانه بیش از یک میلیون گیاه تولید می گردد. این رقم در سال 1985 برای هر 18 آزمایشگاه سالانه به 60 میلیون گیاه رسید. پیشرفت مهم دیگری که در سال 1962 صورت گرفت معرفی و تولید محیط کشت MS (موراشیگ و اسکوگ) بود. این محیط یکی از بهترین محیط های کشتی است که امروزه نیز کاربرد دارد.

برای آشنایی بیشتر در مورد تاریخچه کشت سلول و بافت می توان به موارد ذیل اشاره نمود:

1902: اولین کوشش در کشت بافت گیاهی توسط هابرلنت.

1904: اولین کوشش برای کشت جنین از بعضی گیاهان خانواده شب بو توسط هانیگ.

1922: کشت درون شیشه نوک ریشه توسط رابین.

1934: کشت موفقعیت آمیز ریشه های گوجه فرنگی توسط وایت.

1936 : کشت بافت بازدانگان مختلف توسط دارو.

1939 : کشت موفق ومداوم کالوس توسط گوتره، نوبه کورت و وایت.

1950: باززائی اندامها از بافتهای کالوس درسکویا توسط بال.

1960: تکثیر رویشی ارکیده به وسیله کشت مریستم توسط مورل.

1962: تولید محیط کشت معروف موراشیگ و اسکوگ ( MS ) توسط موراشیگ واسکوگ.

1964: تولید اولین گیاه تا توره ها پلوئید از کشت دانه گروه توسط گِها و شوواری.

1969: اولین جداسازی موفق پروتوپلاست از کشت سوسپانسیون Hapopappus توسط اریکسون و جانسن.

1974: انتقال بیولژیکی در کشت بافت گیاه توسط رین هارد.

1985: آلودگی و انتقال قطعات برگ بوسیله اگروباکتریوم و باززائی گیاهان انتقال یافته توسط هدرج و همکاران.

 

خصوصیات آزمایشگاه کشت سلول و بافت

تعیین محل آزمایشگاه کشت بافت، تصمیم مهمی است. آزمایشگاه نباید در مجاورت آزمایشگاه هایی که از میکروارگانیسم ها و یا حشرات استفاده می کنند یا محل ذخیره بذر و مواد گیاهی هستند،تأسیس شود زیرا انتقال آلودگی از طریق دریچه هوا و رفت و آمد زیاد،مسئله ساز می گردد.

رفت و آمد زیاد موجب بالارفتن غبار از کف زمین شده و به گسترش آلودگی کمک می کند. ازقراردادن گلدان حاوی گیاه در فضای آزمایشگاه کشت بافت اجتناب شود چون می توانند منبعی از کنه ها و سایر موجودات آلوده کننده دیگر باشد. بلافاصله بعد از پایان کار در مزرعه یا گلخانه، نباید وارد آزمایشگاه شد زیرا احتمال ورود کنه و حشرات چسبیده به مو یا لباس به داخل آزمایشگاه وجود دارد.

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

تجهیزات آزمایشگاهی

تجهیزات و وسایل لازم برای یک آزمایشگاه کشت بافت به شرح زیر است:

- اتوکلاو، از این وسیله برای استیل کردن محیط های کشت و وسایل شیشه ای استفاده می شود

 

- دستگاه لامینار ایرفلو یا هود استریل ، مولد هوای استریل می باشد. هنگام کشت ، گیاه را زیر

.هود استریل کشت دهید

 

- مواد شیمیایی، منظور محیط های کشتی است که برای کشت استفاده می شود. محیط های

کشت عموماً دارای عناصر ماکرو و میکرو، ویتامین، هورمون ، قند و آگار می باشد ( پس از تهیه محیط H p آن بین 7-5

 

- دستگاه آب مقطرگیری

 

- آون (فور)، وسایل فلزی توسط این دستگاه استریل می گردد.

 

- اتاقک رشد یا Growth chamber ، در این اتاقکها از لامپهای آفتابی و مهتابی استفاده شده و دما طوری تنظیم می گردد که تا حدود 25 درجه سانتیگراد باشد (با استفاده از تایمر می توان فتوپرید مناسب را برای هر گیاه را ایجاد نمود).

 

- Hot Plate Magnet ، در تهیه محیط کشت از این دستگاه استفاده شود.

 

- ترازوی حامل، حساسیت آن باید از001/0 باشد تا موادی با مقادیر کم (مانند هورمونها) را نیز بتوان وزن کرد.

 

- شیکر ، در کشت مایع از آن استفاده می شود.

-PH متر

- مواد لازم برای استریل کردن جداکشت، محیط کشت و ابزار کار (شامل هیپوکلریت سدیم و الکل

اتیلیک 70%)

 

- منبع گاز دستگاه لامینار

 

- یخچال و فریزر

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

تاقک استریل (دستگاه لامینارایرفلو)

گرچه آماده سازی و قطع قلمه ها، قطعات کالوس و غیره، در یک ظرف شیشه ای و یا در بین ***** کاغذی استریل انجام می شود، ولی انجام این کار در اتاقک استریل ضرورت دارد. هنگامی که اعمال فوق در یک فضای غیراستریل انجام شود میزان آلودگی افزایش چشمگیری می یابد، حتی اگر از کاغذ استریل جهت کار استفاده شود. اتاقک استریل محلی است که هوای مکیده شده از خارج قبل از ورود به آن ، با عبور از *****های بسیار ریز، تصفیه می شود. این سیستم تصفیه جریانی از هوای استریل ایجاد می نماید، همچنین به منظور ضدعفونی خشک از چراغ الکلی یا چراغ گازی استفاده می شود.

کلیاتی در مورد استریل کردن

استریل کردن شامل استریل مواد گیاهی (جداکشت ها) ، محیط کشت و ابزار مورد مصرف در کشت سلول و بافت می باشد. در مورد مواد گیاهی یا جداکشتها، ابتدا سطح اندامی که قرار است به عنوان جداکشت استفاده شود (مثل شاخ و برگ یا ریشه....) را با مایع ظرفشویی شسته و به خوبی آب کشی کرده سپس جداکشت مورد نظر را تهیه و در محلول هیپوکلریت سدیم (وایتکس) قرار می دهیم. باتوجه به نوع گیاه و نوع جداکشت ، تیماری که برای استریل کردن استفاده می کنیم ، متفاوت است. به این معنی که رقت محلول هیپوکلریت سدیم و زمان قرار دادن جداکشت در آن بسته به نوع گیاه متفاوت است (باید توجه نمود تا نمونه تیره نشود). لازم به توضیح است که جداکشت یا Explant ( به قطعه ای از گیاه که در محیط کشت قرار می گیرد گفته می شود) را می توان از تمام قسمتهای یک گیاه اعم از سیستم انتهای ساقه، برگ، ساقه، ریشه و ... بدست آورد.

از دیگر مواردی که نیاز به استریل کردن دارد، محیط های کشت می باشد. پس از تهیه محیط کشت دلخواه آن را در شیشه های درب دار (شیشه های سس مایونز شیشه های مناسبی است چرا که هزینه کمی هم دربر دارد) ریخته و در اتوکلاو استریل نمایید.

توجه: درب شیشه های حاوی محیط کشت استریل تنها باید هنگام کار در زیر دستگاه لامینار (اتاقک استریل) باز شود.

استریل کردن ابزار کار نیز از جمله مواردی است که باید رعایت گردد. ابزار فلزی مورد نیاز از جمله دسته تیغ یا قیچی و پنس را داخل فویل آلومینیوم پیچیده و در آون با حرارت 200 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت استریل کنید. ظروف پتری را نیز می توان مشابه ابزار فلزی استریل نمود. هورمونها و برخی ویتامینها که به دمای بالا حساس هستند را بعد از استریل شدن محیط کشت و در زیر دستگاه لامینار با استفاده از *****های غشایی به محیط کشت اضافه نمائید.

Heat Therapy ، تیمارگرمائی

تیمارگرما برای خلاصی از عوامل آلودگی در گیاه استفاده می شود. یکی از مهمترین عوامل آلودگی، ویروسها می باشند. گیاهان و ویروسها واکنش یکسانی به تیمارگرمایی نشان نمی دهند اما باید تعادلی به وجود آید که هم به گیاه اجازه رشد داده شود و هم بیشترین میزان حذف ویروس را داشته باشیم . همانطور که می دانیم در شرایط رشد طبیعی به موازات رشد انتهایی ساقه، ویروس نیز به بافتهای جدید منتقل می شود. اگر گیاه بتواند در درجه حرارتهای بالا رشد کند، در این صورت احتمال کاهش سرعت همانند سازی ویروس وجود دارد و در نتیجه انتهای ساقه می تواند سریع تر از ویروس رشد کرده و عاری از ویروس گردد. سپس می توان انتهای ساقه را که عاری از ویروس است، قطع و آن را کشت نمود. دمایی که معمولا استفاده می شود 36 تا 37 درجه برای چند روز (تا 7 روز) در ماه است. استفاده از برخی مواد شیمیایی در محیط کشت نظیر Ribavirin نیز منجر به تولید گیاه عاری از ویروس می گردد.

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

عوامل و فاکتورهای خارجی و داخلی موثر در سیستم های کشت بافت :

هدف از کشت بافت کنترل شرایطی است که ریز نمونه در آن رشد می کند ؛ تا اینکه بتوانیم رشد زیر نمونه را در جهت مورد علاقه تغییر دهیم. از فاکتورهای خارجی موثر در سیستم کشت بافت می توان نور ، حرارت ، رطوبت و سایر شرایط اطراف محیط کشت از جمله آلودگی و سایر موارد را در نظر گرفت . از عوامل و فاکتورهای داخلی موثر در سیستم های کشت بافت نیز می توان به انتخاب مواد گیاهی مناسب و یا به طور کلی به شرایط کشت اشاره کرد .

فاکتورهای خارجی :

1. نور: معمولا کیفیت و طول مدت نور مدنظر قرار می گیرد (JOHN H.DODDS &LORIN W (ROBERTS ;1985 معمولا از طریق لامپ های لوله ای فلورسنت ، یا سفید همراه با لامپ های Incandenscent globes یا لامپ های لوله ای که تقریبا 50-30 اشعه می دهند ، تامین می شود. این مقدار کم اشعه جهت واکنشهای ریخت شناسی کفایت می کند ، اما برای فتوسنتز کافی نیست . به دلیل وجود سازوکار در محیط کشت ، فتوسنتز ضرورت ندارد. فتوپریود یا طول روز معمولا 16-12 ساعت است و گاهی 24 ساعت است . برای کارهای عادی در حجم کم ، یک ناحیه شدیدا سایه در یک اتاق شیشه ای یا مجاور پنجره یک اتاق می تواند کافی باشد.کشت ها برای آغاز توسعه کلروپلاست ها و فتوسنتز اغلب در روشنایی پرورش داده می شوند. البته بهترين دوره نوري براي ريزنمونه در محيط درون شيشه اي همان دوره نوري است كه براي گياه مادري مناسب است .

 

2. درجه حرارت : اکثر کشت ها در دمای اتاق یعنی oc 25-20 نگهداری می شوند. محیط های گرم و مرطوب یا گرد و خاکی نسبت به محیط های خنک با رطوبت نسبی پایین و با گرد غبار کم ، بیشتر دچار آلودگی می شوند. در بسیاری از آزمایشگاهها از دستگاههای تنظیم کننده درجه حرارت هوا ( مثل کولر گازی ) جهت کنترل درجه حرارت آزمایشگاه و محیط اتاق رشد استفاده می کنند.

ضرورت دارد که از دستگاهی استفاده نمائیم که کمترین جابجایی هوا را داشته باشد ، بعلت اینکه جریان هوا منبع مهم آلودگی ها محسوب می شود.

 

3. رطوبت : نور و درجه ی حرارت از عوامل محیطی اصلی محسوب می شوند ، تا اینکه مقادیر رطوبت در داخل ظروف در بسته حفظ شود.

شرایط فیزیکی و شیمیایی در محیط آزمایشگاهی، مهم است(Trevor A. Thorpe;2007). این نکته بسیار مهم است که اتاق کشت یا اتاق رشد تا حد امکان تمیز باشد . استفاده از هوای ***** شده توسط صافی HEPA و حفظ فشار مثبت در اتاق کشت از بروز بسیاری از مشکلات جلوگیری می کند.

از مشكلات كشت بافت مي توان به انواع آلودگيهاي باكتريايي وقارچي اشاره كرد كه در برخي موارد كار را با شكست مواجه مي سازد(دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385)وتا حد امكان بايد مكان وتجهيزات كشت به دور از هر گونه آلودگي باشد.

انكوبه كردن كشتها:

كشتهاي تازه تهيه شده بايد جهت رشد ونمو مطلوب ومناسب در شرايط محيطي تنظيم شده اي از لحاظ درجه حرارت،شدت نور و مقدار رطوبت قرار داده شوند.براي انجام اين امر از يك انكوباتور يا اطاقي كه شرايط محيطي آن كنترل شده است استفاده مي كردد(د كتر افشاري پور سليمان،(1372.

اتاقك رشد

محلي است كه در آن سه عامل محيطي دما،نور ورطوبت قابل كنترل است.اكثر اتاقكهاي رشد مي توانند دماهاي 4-40 را فراهم نمايند.تعدادي لامپ فلورسنت نور مورد نياز اتاقك كشت را تأمين مي كند.معمولأ 16 ساعت نور و8 ساعت تاريكي در اتاقك رشد تنظيم ميشود.

اتاقك هاي رشد مي توانند شدت نوري بين 10000-400 لوكس را تأمين كنند. در مورد بافتهاي بدون كلروفيل نيازي به وجود نور نيست،در صورتيكه ريزنمونه هاي كلروفيل دار جهت انجام فتوسنتز نياز به نور دارند.منبع تأمين نور لامپهاي فلورسنت هستند(دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385).

دما از ديگر عوامل مهم در اتاقك رشد مي باشد.اكثر ريزنمونه هاي گياهي در دماي حدود 25 درجه سانتيگراد به خوبي رشد مي كنند.البته گياهان گرمسيري به دماي بالاتر(29-28) وگياهان پيازي به دماي كمتري(18) نياز دارند(باقري،ع وصفاري،م ،1376).

رطوبت نسبي اتاقك رشد نيز از عوامل موثر در رشد ريزنمونه است. رطوبت داخل اتاقك رشد نيز قابل تنظيم بوده معمولأ رطوبت نسبي اتاقك رشد بين 50-40% تنظيم مي شود.افزايش رطوبت موجب افزايش آلودگيهاي قارجي وكاهش آن موجب از دست رفتن آب ريز نمونه مي شود. معمولأ 50% رطوبت براي اتاقك رشد كافي است.

تهويه مناسب وتأمين اكسيژن عامل مهم رشد سلولها وبافتها است.به همين جهت در صورتي كه محيط كشت مايع باشد بايد آن را روي شيكر قرار داد ويا با استفاده از كاغذ صافي وايجاد پل كاغذي اكسيژن محيط كشت را تأمين كرد.در محيطهاي كشت جامد با قرار دادن غيرقطبي ريزنمونه مي توان اكسيژن مورد نياز را تامين نمود. به منظور قرار دادن تعداد زيادي ريزنمونه، اتاقك رشد را به طبقاتي تقسيم مي كنند،كه فاصله بين طبقات مهم است.كاهش فاصله بين طبقات باعث كاهش تهويه وافزايش دما ميشود (دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385).

در اتاق كشت براي سنجش دما ورطوبت مورد نظر از دماسنج ورطوبت نگار نصب شده استفاده مي شود(دكتر پيري خسرو ومهندس نظريان فرهاد،1380).

عوامل و فاکتورهای داخلی موثر در سیستم های کشت بافت :

1) انتخاب مواد گیاهی مناسب:

1-1- انتخاب گیاه مادری با توجه به ژنوتیپ ، شرایط گیاه ، عضو گیاه ( جوانه یا گره )، اندازه ریز نمونه، سهولت کشت، موقعیت ریز نمونه ها روی گیاه مادری، بافتهای بیمار، شیمرها و پلی پلوئیدی تعیین می گردد.

ژنوتیپ

صرفنظر از انتخاب فرمهای مورد علاقه ی گونه ها ، گرایش طبیعی برای کشت بافت بلاخص تشکیل ریشه های نابجا نیز ممکن است قابل توارث باشد. استفاده از طیفی از والدینی که از نظر ژنتیکی متفاوتند ، امکان پذیر است.

شرایط گیاه

در کشت بافت ، اگر ریز نمونه ها از گیاهان سالم و قوی تهیه شوند ، احتمال موفقیت بیشتر می شود.

عضو گیاه

معمولترین عضو مورد استفاده ، جوانه یا گره می باشد ؛ اما بر حسب گونه ی گیاهی و هدف مورد نظر ، ممکن است از اجزای دیگر گیاه استفاده شود.

اندازه ی ریز نمونه

هر قدر که اندازه ریز نمونه کوچکتر باشد ، احتمال انتقال بیماریهای درون زا یا تنوع ناشی از شیمر ( در مواردی که شیمر وجود دارد )کمتر است. از طرف دیگر ، در ریز نمونه کوچکتر ، احتمال آسیب دیدن آن در طول عملیات کشت و همچنین احتمال عدم موفقیت در کشت اولیه بیشتر می شود.

سهولت کشت

کشت بافت بعضی گونه ها یا ارقام ، راحت تر از بقیه است . معمولا کشت بافت گیاهانیکه براحتی از طریق قلمه زنی سنتی تکثیر می شوند ، ساده تر است و بالعکس.

موقعیت ریز نمونه در روی گیاه مادری

انتهای ساقه ها و جوانه های در حال رشد بهترین ریز نمونه ها هستند. از ریز نمونه هایی که در تماس با خاک هستند اجتناب نمائید؛ بخاطر اینکه احتمال آلودگی آنها زیاد است.

بافتهای بیمار

صرفنظر از آلودگی سطحی ممکن است دارای میکرو ارگانیسم های بیماریزا باشند . فقط بافتهای سالم را انتخاب کنید. انتهای ساقه هایی با رشد فعال ، آلودگیهای کمتری دارد.

شیمرها

بعضی گیاهان مستعد جهش های ژنتیکی موضعی یا شیمرها ( مثل قطعات رنگی روی برگها یا اشکال مختلف برگ در روی یک شاخه ) می باشند. چنین صفات ژنتیکی در کشت بافت ایجاد خواهند شد. با اینحال ، بعضی از صفات شیمرها ممکن است که بطور اختصاصی بعنوان یک خصوصیت مطلوب و مورد علاقه انتخاب شوند.

پلی پلوئیدی

در سلولهای بافتهای گیاهانی از هر کروموزوم، یک جفت وجود دارد. تعداد کروموزوم ها در بعضی گیاهان با بافتها ممکن است بیشتر باشد( پلی پلوئیدی ) ؛ با اینکه تعداد کروموزوم های آنها کاهش یافته باشد. این حالتها ممکن است ناشی از ناهنجاریهای طبیعی و یا به علت تیمارهای شیمیایی و غیره باشند. دانه های گرده بطور طبیعی هاپلوئید هستند، یعنی فقط یک دسته کروموزوم دارند. بر حسب وضعیت ، این تفاوتها ممکن است یک مزیت و یا یک مشکل باشند. (اكرم م تاجي و همكاران،1382).

در مورد اندامهاي ذخيره اي مانند پياز وغده بايد ابتدا ركود آنها شكسته شود( باقري ع وصفاري م،1376)

1-2- چرخه های رشد گیاه

که شامل سن بافت ، جوانه ها ، دوره ی فعالیت می باشد.

جوانی / بلوغ

بافتهای بالغ بعد از چندین چرخه ی رشد گیاه ، تولید می شوند. بنابراین معمولا با سیستم ریشه ی دانه رست اولیه یا حتی آنهائیکه ممکن است تازه شروع به رشد کرده باشند، مقداری فاصله دارند. بالعکس ، بافتهای جوان از قسمتهای مختلف نوساقه تولید می شوند. بافتهای بالغ خصوصیات فیزیولوژیکی متفاوتی دارند که بر روی نیازمندیهای کشت آن تاثیر می گذارد.

رویشی / زایشی

جوانه ها ممکن است رویشی یا زایشی ( جوانه ی گل ) باشند که به وضعیت آنها و چرخه رشد گیاه بستگی دارد. جوانه های رویشی برای بسیاری از اهداف ارجحیت دارند ؛ به علت اینکه آنها یک نوساقه جدید تولید خواهند کرد، بنابراین به این طریق تعداد نقاط رشد زیاد می شود. حالت فیزیولوژیکی بافتهای نوساقه در طول دوره گلدهی متفاوت است و این مسئله می تواند بر روی پاسخ به کشت بافت جوانه هایی که در آن مان جمع آوری شده اند ، تاثیر بگذارد.

فعّال / خواب

همانند گلدهی، گیاهان و جوانه ها یا بافت ها، دوره های فعالیت یا عدم فعالیت ( خواب ) دارند و این وضعیت های مختلف بر روی پاسخ به شرایط کشت اثر می گذارد.

1-3- وضعیت فیزیولوژیکی

رشد هر بافت یا اندام چه در کشت درون شیشه ای

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
و چه به عنوان بخشی از یک گیاه کامل ، نهایتا توسط شرایط فیزیولوژیکی داخل بافت ها تعیین می شود. گیاه با تغییر شرایط بخشی فیزیولوژیکی داخل بافت به تغییرات شرایط رشد پاسخ می دهد. بدنبال آن نتایج نهائی تغییرات حاصل از شرایط خارجی ممکن است تحت تاثیر شرایط فیزیولوژیکی فعلی داخل بافت قرار گیرد؛ یعنی الگوی رشد همچنانکه تحت تاثیر شرایط داخلی و خارجی قرار می گیرد ، در نهایت توسط حالت فیزیولوژیکی محض تعیین می شود.

در عمل ، اینگونه می توان بیان کرد که شرایط دقیق مورد نیاز برای تحریک رشد ، به خصوص در کشت بافت، بر حشب وضعیت فیزیولوژیکی مواد گیاهی متفاوت است . وضعیت فیزیولوژیکی گیاه به طور طبیعی بر حسب مراحل مختلف رشد گیاه ، تغییر شرایط محیطی و تغییر فصل متفاوت است . که بعضی از این تغییرات را کنترل نمود؛که یا به طور مستقیم از طریق کنترل محیط مانند درجه حرارت ، نور ، تامین آب و تامین مواد غذایی انجام می پذیرد و یا اینکه مستقیما از طریق استفاده از تنظیم کننده های رشد گیاه صورت می گیرد.

انجام زخم روي ريزنمونه ها موجب افزايش جذب مواد غذايي وتنظيم كننده هاي رشد مي شود (دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385).

هورمون های گیاهی ( تنظیم کننده های رشد گیاه )

بسیاری از تغییراتی که در حالت فیزیولوژیکی بافت های گیاهی اتفاق می افتد ، با دخالت هورمون های گیاهی صورت می گیرد. این مواد شیمیایی با غلظت های خیلی کم در بافت ها وجود دارند و رشد و نمو سلول ها را کنترل می کنند.

سطوح هیدرات کربن

گیاهان و بافت ها دوره های افزایش و کاهش هیدرات کربن را طی می کنند که نتیجه ی تغییر در سطوح هیدرات کربن در بافت ها می باشد، و معمولا این موضوع در ارتباط با چرخه های رشد می باشد. آنها ممکن است بر روی پاسخ های رشد نیز موثر باشند(اكرم م تاجي و همكاران،1382).

وضعیت تغذیه

در مورد وضعیت تغذیه دو پارامتر ، یعنی مقادیر عناصر قابل دسترس و تعادل بین آنها وجود دارد . وضع تغذیه ای گیاه مادری هم ممکن است موثر باشند.

خواب ( Darmancy)

گیاهان بطور پیوسته به یک نسبت رشد نمی کنند . رشد بخشهایی از گیاه ممکن است برای دوره ای آهسته و یا متوقف شود که معمولا به این دوره خواب گفته می شود . در هر گیاهی رشد بخش های مختلف ممکن است بطور همزمان یا غیر همزمان باشد. حالت خواب ممکن است که در مراکز رشد بخصوصی ، مثل ساقه ها ، ریشه ها ، برگها و جوانه ها اتفاق افتد. براساس منشاء باز دارنده ی رشد سه نوع خواب قابل تشخیص می باشد که می تواند توسط عوامل ذیل رخ دهد :

ـ غالب شدن شرایط محیطی ، مانند کاهش یا افزایش فوق العاده درجه حرارت ( خواب محیطی یا تحمیلی

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
)

ـ بازدارندگی ناشی از اثر سایر بخش های گیاهی ، مثلا یک نقطه رشد انتهایی فعال می تواند از رشد جوانه های جانبی قسمت های پایین تر جلوگیری نماید ( غلبه انتهایی

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
) یا یک برگ از رشد جوانه ی روی محورش ممانعت کند ( ممانعت همبسته

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
).

ـ وقوع شرایطی در زمان زودتر، منجر به تغییراتی در داخل بافتها می شود که متعاقبا از رشد جلوگیری می کند، مثلا خواب زمستانه ی جوانه ها ، بعلت شرایط دوره رشد تابستان گذشته است ( استراحت

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
).

هدف ما در کشت بافت تحریک رشد و نمو سریع جوانه ها است ، لذا لازم است که از وقوع خواب جلوگیری شود یا اینکه خواب را بشکنیم . با فراهم نمودن شرایط مناسب محیطی تحت کنترل ، به راحتی می توان از وقوع خواب محیطی جلوگیری کرد. همچنین از طریق جدا کردن جوانه ها یا حذف نقطه ی رشد انتهایی و حذف برگها می توان از وقوع خواب همبسته جلوگیری کرد . با استفاده از سیتوکینین ، غلبه ی انتهایی ساقه حذف شده و جوانه های جانبی شروع به رشد می کنند و بدینوسیله تعداد نوساقه ها افزایش می یابد .

با این حال ، با چنین تیمارهای مستقیمی ، نمی توان نوع سوم خواب را ، یعنی استراحت ، که در داخل جوانه یا بافت قرار داد ، حذف نمود. با انتخاب ریز نمونه از قسمت هایی از گیاه که در خواب نیستند ، مثل انتهای ساقه ای با رشد فعال یا جوانه دقیقا در زمان قبل از رشد بعدی ، ممکن است که بر استراحت غلبه کرد. مدیریت گیاهان مادری به گونه ای می تواند باشد تا از به خواب رفتن آنها جلوگیری شود.

نور

صرفنظر از اینکه نور منبع انرژی برای فتوسنتز است ، اثرات مختلفی بر روی رشد گیاه دارد. بالعکس، حذف نور از گیاه یا یک بافت بخصوص، می تواند بر روی فیزیولوژی آن تاثیر بگذارد. تحت شرایط شدت نور کم یا تاریکی، میزان هیدرات کربن کاهش می یابد. با تغییر در شدت ، دوره ، یا کیفیت نور ( رنگ یا طول موج) میزان هورمون های درون زا یا سایر اجزاء فیزیولوژیکی گیاه ممکن است که تغییر کند. این اثرات می تواند بر روی گیاه مادری یا در هر مرحله ای از کشت اتفاق افتد(اكرم م تاجي و همكاران،1382).

تنش آب

در شرایط تنش آبی ، علاوه بر پژمردگی موقت یا احتمالا دائم ، تغییرات فیزیولوژیکی پایداری ممکن است اتفاق افتد . این تغییرات ممکن است که بر روی سایر واکنش های فیزیولوژیکی فوق الذکر نیز تاثیر بگذارد . تحت شرایط تنش آبی ، اسید آبسزیک در بعضی از بافت ها ، بخصوص برگها ، تجمع پیدا می کند . این مسئله ممکن باعث القا خواب یا استراحت شود . در برخی موراد یک دوره تنش آبی تا حد قبل از مرحله ی کشندگی باعث شروع گلدهی می شود. پژمردگی و به تبع آن آسیب دیدن بافت ها ، بالاخص در زمان تهیه ریز نمونه ها ، نگرانی های اصلی کشت بافت هستند.

2) ایجاد کشت های عاری از بیماری :

ریز نمونه و کشت ها ممکن است که توسط انواع میکروارگانیسم ها مانند قارچها ، باکتریها ، حشرات و یا ویروسها آلوده شوند . چنین ارگانیسسم هایی معمولا در سطح و داخل بافتهای گیاهی وجود دارند. بسیاری از آنها بیماریزا نیستند؛ یعنی تحت شرایط طبیعی ، آسیبی به گیاه میزبان وارد نمی کنند. شرایط خشک و حضور موجود زنده ی رقیب ممکن است آنها را تحت کنترل نگه دارند. با این وجود ، شرایط درون شیشه ای مناسب برای رشد گیاه ، یعنی سطوح بالای عناصر معدنی ، ساکارز ، رطوبت نسبی و درجه حرارت بالا ، باعث رشد و تکثیر سریع میکروارگانیسم ها شده و در نتیجه ریز نمونه های کشت شده بر اثر شدت آلودگی نابود می شوند.

علاوه بر آلودگی های ایجاد شده توسط ارگانیسم ها و میکروارگانیسم ها، ترشحات حاصل از ریز نمونه ها نوع دیگری از آلودگی محسوب می شود. وقتیکه بافت های گیاهی از طریق بریدن یا توسط تیمارهای شیمیایی مانند محلول کلرین زخمی می شوند ، در سلول های اطراف زخم واکنش های فیزیولوژیکی اتفاق می افتد. بخشی از این فرایند ، تولید شیمیایی است که یا در اثر تجزیه ی فرآورده بوجود می آید و یا بعنوان مکانیسم دفاعی سنتز می شوند. تراوش مقداری از این مواد در بافت ها ممکن است اتفاق افتد . این مواد در بافت ها ممکن است اتفاق افتد. این مواد شیمیایی ممکن است بر روی کشت ها ف اثرات زیان آوری داشته یا نداشته باشند.

اتیلن ماده ی شیمیایی دیگری است که قابل مشاهده نیست ، ولی می تواند اثرات معنی داری داشته باشد. اتیلن به طور طبیعی در بافت های گیاهی تولید می شوند و نقش هورمونی در رشد و نمو گیاهان دارد. اتیلن اغلب در نتیجه یک تنش مانند زخمی شدن یا خشک شدن بافت ها تولید می گردد. اتیلن ممکن است در ظروف کشت تجمع یافته و بر روی ریز نمونه ها تاثیر بگذارد. پیری و نکروزه شدن برگ ها از علائم تجمع گاز اتیلن محسوب می شود.

3) شرایط کشت :

3-1- نوع بستر کشت ( سوبسترا )

اکثرا کارهای ریزازدیادی در محیط های کشت نیمه جامدی انجام می شود که از آگار یا اخیرا از "ژلرایت" جهت سفت کردن آنها استفاده می شود. این ژلها نشیمنگاهی را برای ریز نمونه ها بوجود آورده و تهویه محیط کشت را افزایش دهند(اكرم م تاجي و همكاران،1382).نقش مهم دیگر محیط کشت فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای یاخته ها و بافت ها برای رشد می باشد(خسروشاهی وبهنامیان،1385).

از محیط کشت مایع اغلب در کشت کالوس و سلول ، که جهت جلوگیری از خشک شدن باید در محیط کشت غوطه ور شوند، استفاده می شود. نوع بستر محیط کشت می تواند بر روی نوع رشد و نمو ، مثلا ریخت شناسی ریشه تاثیر بگذارد.

3-2- pH محیط کشت

pH بر جذب یون ها و همچنین انجماد عامل ژل مو ثر است. pH بهینه 5.8 قبل از اضافه كردن آگار به محيط كشت است. مقادیر pH پایین تر از 4.5 و یا بالاتر از 7.0 تا حد زیادی مانع از رشد و توسعه در شرایط آزمایشگاهی است(Dr. Rhitu Rai;2007).معمولا pH محیط کشت در زمان تهیه ی محیط کشت روی 5/5 تنظیم می شود. pHمحیط کشت می تواند بر روی قابلیت حل شدن عناصر غذایی ، جذب آنها بوسیله ی مواد گیاهی و سفت شدن آگار موثر باشد یا اینکه اثرات ریخت شناسی داشته باشد معمولا از تغییرات محیط کشت در طول زمان و در هنگام اتوکلاو کردن چشم پوشی می شود (William et al .,1990).

روش اندازه كيري pH‏ محيط كشت به اين صورت است كه قبل از اضافه كردن آگار به محيط كشت بايدpH‏ آن را تنظيم كرد.پس از قرائت pH‏ اگرpH‏ اسيدي بود با اضافه كردن سود 1 نرمال،pH‏ محيط كشت به pH‏ مورد نظر رسانده مي شود ودر صورت قليايي بودن محيط كشت با افزودن اسيد كلريدريك 1 نرمال pH‏ تنظيم ميشود (دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385)

همچنین ممکن است یک اثر متقابلی بین pHمحیط کشت و سایر عوامل در محیط کشت وجود داشته باشد. نتایج کار ما نشان داده است که pH می تواند بر روی واکنش ریز نمونه نسبت به هورمون های استفاده شده به ویژه در تشکیل ریشه اثر قابل توجهی داشته باشد (William et al .,1990).

3-3- محیط های کشت ، عناصر غذایی و نیازمندی های رشد

محيط كشت مناسب براي رشد،تقسيم وتمايز سلولهاي ريزنمونه بايد داراي آب،مواد غذايي،ويتامين ها به عنوان تنظيم كننده فعاليت متابوليكي سلولها وساير موادي باشد كه سبب تسريع رشد ريزنمونه مي كردد.علاوه بر آن محيط كشت نقش نگهداري ريزنمونه را نيز بر عهده دارد(دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385).

محیط کشت یکی از اجزای بسیار مهم فنون کشت یاخته و بافت گیاهی است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گیاهی به میزان زیادی به محیط کشتی با ترکیب صحیح بستگی دارد. ترکیب محیط های کشت بسته به روش خاص کشت به کار رفته تغییر می یابد )خسروشاهی وبهنامیان،1385(. در کشت بافت ، همه ی عناصر ضروری که به طور طبیعی در خاک هستند را بایستی به نسبت های مسای ( در مقایسه با خاک ) در محیط کشت قرار داد. قابلیت استفاده از مواد غذایی تحت تاثیر متعادل بین عناصر یا PH محیط کشت قرار می گیرد(اكرم م تاجي و همكاران،1382).

یکی از مشکلات کشت بافت گیاهی این است که نیازهای تغذیه ای جهت رشد مطلوب ، در اکثر گونه ها بسیار متفاوت است ، بنابراین نمی توان یک محیط کشت واحدی را برای استفاده در همه موارد توصیه نمود. کارهای کشت بافت انجام شده طی 30 سال گذشته منجر به ایجاد محیط های کشت متعددی شده است که امروزه تعداد کمی از آنها بطور گسترده در کشت بافت گیاهی استفاده می شوند.

محیط کشت مورد استفاده برای کشت سلول های گیاهی در شرایط آزمایشگاهی متشکل از سه اجزای اصلی:

1 عناصر اساسی، یا یونهای معدنی و مخلوطی از نمک

2 مکمل های آلی ویتامین ها و اسیدهای آمینه

3 منبع کربن ثابت، معمولا ساکارز به عنوان قند(JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985)

ترکیب محیط های کشت بافت

عناصر معدنی :

تعداد 12 ماده غذایی معدنی برای رشد گیاهان ضروری هستند و همچنین گزارش شده که تعدادی دیگری هم در شرایط درون شیشه ای بر روی گیاهان موثرند. جهت رشد نرمال در شکست بافت ، این عناصر ضروری باید در محیط کشت وجود داشته باشند.

معمولا براساس غلظت های ضروری به دو گروه تقسیم می شوند : عناصر پر مصرف

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
که در مقادیر زیاد (غلظت های میلی مول) و عناصر کم مصرف

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
که تنها در غلظت های بسیار پایین ( میکرومول ) ضروری می باشند.

عناصر پر مصرف

1. نیتروژن (N) : نیتروژن یکی از عناصر ضروری برای زندگی گیاه است زیرا جزء سازنده درونی بسیاری از ترکیبات بیولوژیکی مهم مانند اسید آمینه ها ، پروتئین ها ، اسید نوکلئیک ها ، کلروفیل و بسیاری از زیست مولکول ها دیگر می باشد. در محیط های کشت گیاهی ، نیتروژن معدنی معمولا در دو شکل تامین می شود ؛ در شکل اکسید شده مانند آنیون نیترات ( ) و در شکل احیا شده مانند کاتیون آمونیوم ( ). غلظت نیتروژن معدنی معمولا 20 تا 40 میلی مول است. به نظر می رسد که بیشتر کشت ها زمانی که با هر دو شکل معدنی تامین شوند بهترین رشد را القا می کنند(خسروشاهی وبهنامیان،1385). در تعدادی از ترکیبات محیط های کشت ، نیتروژن آلی نیز به صورت اسید آمینه ها یا پروتئین های هیدرولیز شده افزوده می شوند. این اشکال آلی نیتروژن را نمی توان به طور کلی جایگزین اشکال معدنی کرد نیتروژن معمولا به عنوان مخلوطی از یونهای نیترات (از غلظت Kno3) ویون های آمونیوم (از NH4NO3) مورد استفاده قرار میگیرد و در غلظت های بالا، یون های آمونیوم می تواند سمی باشد (JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985).

2. گوگرد (S) : مانند نیتروژن ، گوگرد یک جزء حیاتی پروتئین ها در اسید آمینه های سیستئین و متیونین است. هر دوی این اسید آمینه ها به سهم خود پیش سازهایی برای ترکیبات گوگردی ضروری مانند ویتامین ها و سایر کوفاکتورها هستند . علاوه بر این ، گوگرد در پروتئین های آهن ـ گوگرد وجود دارد که حد واسط اکسیداسیون و احیا مهم کلروپلاست ها و میتوکندری ها می باشند. در محیط های کشت گیاهی گوگرد معمولا به میزان 1 تا 3 میلی مول به صورت آنیون سولفات ( ) در ترکیب با منیزیم به صورت سولفات منیزیم تامین می شود.

3. فسفر (p) : فسفر یکی از اجزای اصلی اسید نوکلئیک های و استRNA و DNAبه وفور در فسفولیپیدهای غشاهای زیستی وجود دارد. فسفر همچنین در استرهای فسفات غنی از انرژی مانند ATP موجود است و یک ماده زمینه

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
یا محصول مهم در چندین واکنش متابولیکی است. در محیط های کشت گیاهی فسفر به صورت آنیون فسفات ( ) به صورت فسفات دای هیدروژن پتاسیم یا سدیم

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
در غلظت 1 تا 3 میلی مول تامین می شود.

4. کلسیم (Ca) : کلسیم یک تعدیل کننده مهم عمل آنزیم است و برای سنتز و تثبیت دیواره یاخته ای مورد نیاز می باشد. در محیط های کشت بافت گیاهی کلسیم در غلظت 1 تا 3 میلی مول به صورت نمک کلراید یا نیترات به کار می رود.

5. منیزیم (Mg) : منیزیم به عنوان اتم مرکزی در مولکول کلروفیل ، در تجمع زیر واحدهای ریبوزومی برای سنتز پروتئین مورد نیاز است و به عنوان کوفاکتور ضروری برای بسیاری از واکنش های آنزیمی عمل می کند. همچنین منیزیم ممکن است در تعادل کاتیون ـ آنیون نقش داشته باشد. در محیط های کشت یاخته و بافت گیاهی منیزیم معمولا به صورت سولفات منیزیم در غلظت 1 تا 3 میلی مول افزوده می شود.

6. پتاسیم (k) : پتاسیم کاتیون اصلی در گیاهان است که چندین نقش حیاتی را ایفا می کند. پتاسیم در تنظیم اسمزی ، تعادل کاتیون ـ آنیون و تثبیت PH نقش دارد. پتاسیم همچنین به عنوان یک فعال کننده برای بسیاری از واکنش های کاتالیز شده توسط آنزیم ، ایفای نقش می کند و در چندین مرحله کلیدی در فرایند ترجمه و سنتز پروتئین درگیر است . پتاسیم در محیط های کشت بافت گیاهی ممکن است بر حسب گونه گیاهی تغییر یابد ولی معمولا با غلظت 20 تا 30 میلی مول در ترکیب با نیترات به صورت نیترات پتاسیم تامین می شود.

عناصر کم مصرف

آهن (Fe) : آهن برای سنتز کلروفیل مورد نیاز است و در واکنش های اکسیداسیون و احیاء به عنوان جزء اصلی سیتوکروم ها و پروتئین های آهن ـ گوگرد ایفای نقش می کند. آهن فریک (Fe {III}) در فیزیولوژیکی تقربا نامحلول است ( قابلیت حل پایدار برای Fe(OH) 3، 10 -39است ) و شلاته کننده هایی مانند اتیلن دای آمین تترااستیک اسید

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
برای نگه داری آهن فریک به صورت محلول ضروری است -EDTA. Fe درمحیط های کشت برای قابل استفاده ساختن آهن در دامنه وسیع به کار می رود (خسروشاهی وبهنامیان،1385(.

آهن معمولا به صورت سولفات آهن اضافه شده است، اگر چه سیترات آهن نیز می تواند مورد استفاده قرارگیرد.Ethylenediaminetetra استیک اسید (EDTA) است که معمولا در رابطه با آهن استفاده می شود( JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985)

بُر(B) : بُر جزء تشکیل دهنده برخی از کمپلکس های ساختمانی دیواره های یاخته ای است و برای تقسیم یاخته ای در مریستم های انتهایی ریشه ها مورد نیاز است. در محیط های کشت بافت گیاهی بُر به صورت اسید بریک تامین می شود.

کبالت (Co) : نقش مستقیم کبالت در گیاهان عالی به درستی مشخص نشده است . با وجوداین، کبالت به محیط های کشت گیاهی در حدود 1/0 میکرومول افزوده می شود.

مس (Cu) : نقش اصلی مس ، به صورت متصل شده به پروتئین ، در واکنش های اکسیداسیون و احیاء است . مس به صورت سولفات مس به میزان 1/0 میکرومول به محیط های کشت افزوده می شود. مس در غلظت های بالاتر سمی است.

ید (I) : ید به عنوان یک عنصر کم مصرف ضروری مورد توجه قرارنگرفته است ولی تصور بر این است که ید یک عنصر کم مصرف سودمند است که رشد ریشه ها و پینه را بهبود می بخشد.

منگنز (Mn) : منگنز در متالوپروتئین هایی که دارای نقش ساختمانی هستند یافت می شود و در واکنش های اکسیداسیون و احیاء نیز ایفای نقش می کند . منگنز معمولا در محیط های کشت به میزان 5 تا 30 میکرومول به صورت سولفات منگنز به کار می رود.

مولیبدن (Mo) : مولیبدن کوفاکتور چند آنزیم اکسیداسیون و احیاء از جمله آنزیم نیترات ردوکتاز است که در تبدیل نیترات به آمونیوم مشارکت دارد. مولیبدن معمولا در مقادیر 1/0 میکرومول به صورت مولیبدات سدیم به محیط های کشت افزوده می شود.

روی (Zn) : روی برای فعالیت انواع گوناگونی از آنزیم های گیاهی از جمله دی هیدروژنازها و RNA و DNAپلی مزارها مورد نیاز است . روی به صورت سولفات روی به میزان 5 تا 30 میکرومول به محیط های کشت افزوده می شود(خسروشاهی وبهنامیان،1385(.

جدول 1:برخی از عناصر مهم برای تغذیه گیاه و عملکرد فیزیولوژیک آنها:

(JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985)

 

عناصر غذایی آلی

گیاهان تحت شرایط طبیعی اتوتروف هستند و می توانند تمام مواد آلی مورد نیاز خود را سنتز کنند. علیرغم اینکه گیاهان درون شیشه ای توانایی سنتز این ترکیبات را دارند. ولی بیشتر سیستم های کشت حداقل در مراحل اولیه خود ناپرور ( Heterotrophic) می باشند و به منبع آلی کربن و انرژی نیازمند هستند( خسروشاهی وبهنامیان،1385).

منبع کربن

گیاهان در کشت بافت بصورت هتروتروفیک رشد می کنند و قادر نیستند که مقدار کربن مورد نیاز خود را در حد کافی سنتز کنند . لذا ، یک منبع کربن ( معمولا ساکاروز ) باید به محیط کشت اضافه گردد. منبع کربن علاوه بر تامین انرژی مورد نیاز برای رشد گیاه واحدهای ساختمانی برای تولید مولکولهای بزرگتر مورد نیاز برای رشد گیاه را نیز فراهم می کند. معمولا ساکاروز با غلظت 5-1% بعنوان منبع کربن استفاده می شود (اكرم م تاجي و همكاران،1382).

اكثر ريزنمونه ها فاقد كلروفيل هستند وحتي در صورت داشتن كلروفيل به علت شرايط نامساعد محيطي(تاريكي وعدم وجود co2‎‏ كافي)در محيط درون شيشه اي قادر به انجام فتوسنتز وتأمين هيدرات كربن نيستند وبنابراين لازم است انرژي مورد نياز آنها به نحوي تأمين شود،در حالت عادي غلظت ساكارز در محيط كشت بين 3-2% متغير است اما در محيط كشت القاي جنين غلظت آن به 10% مي رسد.ساير هيدراتهاي كربن شامل گلوكز،فروكتوز،گالاكتوز،را فينوز ومالتوز مي باشد.در كشت پروتوپلاست گلوكز نسبت به ساير هيدراتهاي كربن برتري دارد.در نرزايي(كشت ميكروسپور وبساك)مالتوز بهتر از ساير قندهاست.غلظت هيدرات كربن انتخاب شده بستگي به نوع وسن ريز نمونه دارد.با افزايش غلظت قند تا حد بهينه رشد ونمو افزايش يافته ودر غلظتهاي بيشتر از آن رشد و نمو كاهش مي يابد.(دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385) یک منبع کربن ثابت در شکل قند (اغلب ساکارز) است( JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985) هنگامی که ساکاروز اتوکلاو می شود ، مقداری از آن هیدرولیز شده و تولید گلوکز و فروکتوز می کند که ممکن است بطور موثری مورد استفاده گیاه قرار گیرند. علاوه بر یک منبع آلی از کربن و انرژی ، کشت های گیاهی ممکن است به مولکولهای پیچیده برای رشد سالم نیز نیازمند باشند.

 

قندها

قندها برای تامین کربن و انرژی به محیط های کشت گیاهی افزوده می شوند. ساکارز متداول ترین قند مورد استفاده در محیط های کشت گیاهی است ولی گلوکز ، فروکتوز و سوربیتول در برخی از محیط های های کشت مورد استفاده قرار می گیردند. علاوه بر نقش متابولیکی آن ، ساکارز همچنین به عنوان یک اسمزنگه دار

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
عمل می کند و همراه با عناصر غذایی معدنی به تعادل پتانسیل اسمزی محیط کشت کمک می کند. (خسروشاهی وبهنامیان،)1385 ساکارز، ارزان، به راحتی در دسترس است، به آسانی جذب می شود و نسبتا پایدار است، به همین دلیل شایع ترین منبع استفاده کربن است.( JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985)

ویتامین ها و کوفاکتورها

ویتامین های افزوده شده ، برای کشت های یاخته و بافت گیاهی ضروری نیستند هر چند ویتامین B 1( تیامین) برای کشت های برخی از گونه ها سودمند تشخیص داده شده است . با وجود این ، بیوتین ، اسید پانتوتنیک ، اسید نیکوتینیک ( نیاسین ) ، پیریدوکیسن ( پیرویدوکسول ، ویتامین B 6) ،اسید فولیک ،اسید اسکوربیک ( ویتامین C ) و توکوفرول ( ویتامین E ) به برخی از محیط های کشت افزوده می شود. Dr.Rhitu Rai;2007)). افزودن انفرادی عصاره مخمر

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
گاهی اوقات به عنوان منبع ویتامین ها صورت می گیرد. ويتامين ها نقش كاتاليزوري در واكنشهاي آنزيمي دارند. ويتامين مهم براي كشت سلولهاي گياهي تيامين((B1‎‏‏ است،ويتامينهاي ديگر نظير اسيد نيكوتينيك وپيريدوكسين به محيط هاي كشت سلولي اضافه مي شوند،چون ممكن است پاسخ سلولهاي گياهي به كشت را افزايش دهند(رابر تا اچ اسميت، ترجمه هدايت باقري وپژمان آزادي،1381).

الکل قند میواینوزیتول به وفور در محیط های کشت برای گیاهان تک لپه ای ، بازدانگان و برخی از گیاهان دو لپه ای به کار می رود . این الکل قند نقشی را در توسعه دیواره یاخته و غشا ایفا می نماید.

ميواينوزيتول يك هگزيتول است كه در كشت بافتهاي گياهي با اهميت است(بلارد و همكاران 1961،استين هارت و همكاران 1962).ميواينوزيتول در چرخه بيوسنتز،ذخيره تركيبات پلي هيدريك به عنوان اندوخته،انتقال قند،تغذيه معدني، متابوليسم كربوهيدراتها، ساختمان غشاء، تشكيل ديواره سلولي، پايداري هورموني و فيزيولوژي تنش دخالت دارد(لووس ولووس،1983).

اسیدهای آمینه

اسیدهای آمینه برای تحریک رشد سلولی در کشت پروتوپلاست و همچنین القا و حفظ سلول های سوماتیک مهم هستند که اسیدهای آمینه L- گلوتامین ، L-آسپاراژین، L-سیستئین، L-گلیسین معمولا به صورت مخلوط به محیط اضافه شده و استفاده می شودچون کاربرد جداگانه آنها مانع از رشد سلول می شود(Dr. Rhitu Rai;2007).

افزودنی های آلی پیچیده

افزودنی های پیچیده مانند پودر موز و آندوسپرم مایع نارگیل ( موسوم به شیر نارگیل یا آب نارگیل ) به وفور به برخی از محیط های کشت برای بهبود رشد افزوده می شوند. اگر چه تصور می شود که آب نارگیل ، تنظیم کننده های رشد و ترکیبات آلی دیگر را فراهم می سازد ولی مشخص نیست که اجزای این افزودنی در بهبود رشد کشت ها موثر است یا خیر . به دلیل این تردید برخی از متخصصان از کاربرد این افزودنی های تعریف نشده دلسرد شده اند.

افزودن یک یا چند مورد از این ترکیبات باعث می شود تا به آن " محیط کشت تعریف نشده " اطلاق گردد. با انجام تحقیقات امکان جایگزینی ترکیبات پیچیده با یک ماده بخصوص مثل یک ویتامین یا اسید آمینه ، وجود دارد. ) اکرم م تاجی و همکاران،1382 )

آگار

بعضی از گیاهان یا بافتهای آنها در محیط کشت مایع کشت می شوند. این محیط کشت ممکن است ساکن باشد و یا اینکه معمولا توسط یک همزن تکان داده شود. اکثر بافتها روی محیط کشت جامدی کشت می شوند که توسط آگار یا جانشین آن مانند ژلرایت یا فیتاژل ، ژله ای شده باشد(اكرم م تاجي و همكاران،1382).آگار، تولید شده از جلبک دریایی، شایع ترین نوع آگار است.کیفیت آگار می تواند از یک منبع به منبع دیگر متفاوت باشد ( JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985). طیف غلظت آگار مورد استفاده %7/0-1 است. آگار در غلظت های بالا به شدت سفت شده و آب قابل دسترس در آن کم می شود و در نتیجه انتشار مواد غذایی به بافت های گیاهی ضعیف خواهد بود . آگار با کیفیت بالا مانند دیفکوبی تک

محتوای مخفی

    برای مشاهده محتوای مخفی می بایست در انجمن ثبت نام کنید.
آگار گران است . اما ناخالصی های آن که ممکن است مانع رشد گیاه شود ، کمتر است . در آزمایشگاههای تجاری ، گاهی اوقات از جانشین های دیگر آگار مانند ژلاتین استفاده می شود. (اكرم م تاجي و همكاران،1382). آگارز( عصاره خالص آگار)برای کشت پروتوپلاست استفاده می شود. Dr. Rhitu Rai;2007))

تنظیم کننده های رشد گیاهی در کشت بافت :

هورمونها ترکیبات آلی هستند که در بافتهای گیاهی ساخته می شوند / برای تاثیر بر روی رشد و نمو گیاه فقط به غلظت های خیلی کم از انها نیاز است . مشخص شده است که بسیاری از مولکولهای آلی مصنوعی ، فعالیت بیولوژیکی مشابه به هورمونهای گیاهی دارند. به مجموعه ترکیبات مصنوعی و هورمون های طبیعی تنظیم کننده رشد اطلاق می گردد(اكرم م تاجي و همكاران،1382). تنظیم کننده های رشد گیاهی اجزای مهمی در تعیین مسیر رشد و نمو سلول های گیاهی است هستند

JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985)).

کشت بافت، دستکاری رشد گیاه در شرایط دقیقا کنترل شده است، و اکسین ها و سیتوکینینها از اهمیت ویژه ای در این دستکاری برخوردار هستند . اکثر ریز نمونه ها مقداری اکسین و سیتو کینین درون زا (Endogenous) تولید می کنند. در کشت بافت ، تنظیم کننده های رشد برون زا (Exogenous) جهت تحریک رشد به کاربرده می شوند. پنج گروه اصلی از تنظیم کننده های رشد گیاهی وجود دارد که رشد و تمایزیابی را در گیاهان هماهنگ می کنند و عبارتند از : اکسین ها ، سایتوکینین ها ، جیبرلین ها ، اسید آبسیزیک و اتیلن . اتیلن به ندرت در کشت بافتهای گیاهی به کار می رود.

اکسین ها

این گروه شامل اکسین طبیعی IAA و اکسین های مصنوعی 2,4-DوNAAو IBA می باشد.اكسين طبيعي نسبت به دو عامل نور وگرما ناپايدار است،به همين دليل كمتر مورد استفاده قرار ميگيرد.گاهي اوقات از اكسين هاي اسيد امينه اي (مانند ایندول استیل-L-آلانین و ایندول استیل-L-گلیسین) استفاده مي شود كه تا حدي با ثبات ترند ومشكلات شايع اکسین طبیعی IAA را ندارند(JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985).اکسین های مصنوعی ، نسبتا فعالتر از اکسین طبیعی IAA هستند . مزیت دیگر اکسین های مصنوعی این است که آنها بوسیله آنزیم های موجود در بافت های گیاهی تجزیه نمی شوند . اکسین ها نقش های متفاوتی در رشد و نمو گیاه دارند . اکسین ها با غلظتmgl -1 10-01/0به محیط کشت اضافه می شوند. آنها طویل شدن و رشد سلولی ، تقسیم سلولی ، تشکیل کالوس و تشکیل ریشه های نابجا را تحریک می کنند. اکسین ها همچنین از نمو جوانه های جانبی و تشکیل جنین های سوماتیکی بر روی کالوس جلوگیری می کنند و در غلظت های بالا ممکن است موجب ناهنجاریهای رشدی شدید یا بازداشتن کامل رشد شوند. ( اكرم م تاجي و همكاران،1382).

سیتوکینین ها

این گروه شامل سیتوکینین های طبیعی 2ip و زآتین و سیتوکینین مصنوعی BAPو کینتین هستند.سیتوکنین های مصنوعی ، فعالیت بیولوژیکی بسیار بالایی دارند و گران نیستند ، لذا کاربرد وسیعی در کشت بافت دارند. سیتو کنین ها باعث تورم بافت ، تحریک نمو جوانه های جانبی و نابجا و تحریک تقسیم سلولی می شوند. در کشت بافت گیاهی، نقش سیتوکینین ها در تحریک نمو جوانه جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار با اهمیت است .سیتوکنین ها در حضور گرما پایدار هستند و ممکن است که قبل از اتو کلاو کردن به محیط کشت اضافه شوند و همراه با اکسین ها رشد و نمو گیاه را تنظیم می کنند ( اكرم م تاجي و همكاران،1382).

نكته قابل توجه در مورد كاربرد هورمونهاي اكسين وسيتوكينين در محيط كشت بافت جگونگي نسبت اين دو مي باشد.اكر هدف تحريك جنين زايي،شروع كالوس زايي و همچنين آغاز ريشه زايي باشد بايستي نسبت اكسين به سيتوكينين را زياد در نظر گرفت واگر هدف غير از اين موارد باشد يعني ساقه زايي زيادتر باشد،ريشه تشكيل نشود يا ديرتر تشكيل شود،اين نسبت را بايستي كم در نظر گرفت (دكتر پيري خسرو ومهندس نظريان فرهاد،1380).

اما اگر اين نسبت برابر باشد يعني در حدود 1،آنوقت هيچگونه تمايزي صورت نميگيرد و يك توده سلولي كالوس انبوه ايجاد مي شود كه از اين خصوصيت مي توان در توليد حجم زيادي كالوس وبعدأ تهيه زيركشت هاي متعدد استفاده نمود(دكتر پيري خسرو ومهندس نظريان فرهاد،1380).

اسید جیبرلیک (جیبرلین)

این گروه شامل حدود 60 ترکیب است که GA3 رایجترین آنها در گیاهان است . اسید جیبرلیک را به ندرت در کشت بافت استفاده می کنند . این هورمون در مقابل گرما ناپایدار است و نمی تواند اتوکلاو شود. بنابراین از طریق *****اسیون استریل می گردد و بعد از اتو کلاو کردن محیط کشت به آن اضافه می گردد. عموما نقش اسید جیبرلیک تحریک جوانه زدن بذر و تحریک رشد طولی میانگره ها است( اكرم م تاجي و همكاران،1382) و در تنظیم کشیدگی سلول نقش دارند (JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985).به منظور تحریک طویل شدن شاخساره های خیلی کوچک و تحریک تشکیل جنین روی کالوس، این هورمون به محیط های کشت اضافه می شود( اكرم م تاجي و همكاران،1382). در کشت های بافت گیاهی ، جیبرلین ها برای القای اندام زایی به ویژه تشکیل ریشه نابجا به کار می روند(خسروشاهی وبهنامیان،1385(.

اسید آبسزیک

اسید آبسزیک (ABA) بطور گسترده ای در بافتهای گیاهی وجود دارد و بعنوان یک بازدارنده رشد تلقی می شود.از این هورمون اغلب در کشت بافت استفاده نمی شود ، اما کاربردهای اختصاصی مثل تحریک نمو جنین از کالوس دارد. (George and sherrington , 1984)

این نقش های ABA شاید با توانایی آن در تغییر سنتز سیتوکینین و بعنوان آنتاگونیست جیبرلین در ارتباط باشد درکشت های بافت گیاهی ، اسید آبسزیک برای افزایش جنین زایی سوماتیک به کار رفته است.

اتیلن

اتیلن یک گاز با ساختمان ساده است . اتیلن توسط گیاهان تولید می شود و اعتقاد بر این است که تجمع آن در ظروف درب بسته کشت بافت ، از رشد جلوگیری می کند (George and sherrington , 1984) . اتیلن همچنین توسط بعضی از ظروف پلاستیکی تولید می شود و شعله آتش نیز مقداری اتیلن تولید می کند. بنظر می رسد که اتیلن با سایر تنظیم کننده های رشد اثر متقابل دارد و در پیر شدن بافتهای گیاهی دخالت دارد. اتیلن در پاسخ به Waterlogging ، شرایط مشابه به کشت درون شیشه ای ، تولید می شود. اتیلن در غلظت های بالاتر باعث تحریک پر آب شدن ( شیشه ای شدن ) بافت های گیاهی می شود( اكرم م تاجي و همكاران،1382).

سایر موارد :

1ـ آدنین

آدنین مکررا به محیط کشت اضافه می گردد و نشان داده شده که اثرات مفیدی بر روی تولید نوساقه دارد. با وجود اینکه نحوه ی فعالیت آدنین ناشناخته می باشد ، ولی چون پیش نیاز سیتوکینین است ، احتمالا سنتز عمده ی سیتوکینین نقش داشته باشد.

2ـ زغال فعال

بسته به گونه های گیاهی برای هر دو عمل ارتقاء و مهار رشد در محیط کشت کاربرد دارد. گزارش شده است در ارکیده، هویج، پیچک و گوجه فرنگی رنگدانه های قهوه ای، سیاه و سفید و اکسیده فنولیک تولید شده را جذب کرده ودر نتیجه کاهش سمیت شده و موجب تمایزو تحریک رشد می شود.در حالیکه در تنباکو، سویا و غیره باجذب دیگر ترکیبات آلی مانند PGRs، ویتامین ها و غیره ممکن است باعث مهار رشد شود. همچنین یکی دیگر از ویژگی های زغال فعال است که باعث تیرگی محیط شده و به تشکیل ریشه و رشد کمک می کند( Dr. Rhitu Rai;2007).این ماده در غلظت های بین 2/0 تا 3/0 در محیط های کشت استفاده می شود . زغال فعال ، از طریق جذب می تواند مواد را از محیط کشت حذف کند ؛ پس این مواد در دسترس ماده ی گیاهی قرار نمی گیرند . نشان داده شده که زغال فعال همانطور که می تواند مواد سمی برای رشد سلول ( مانند پلی فنلها ) را از دسترس بافت خارج سازد، قادر است که تنظیم کننده های رشد محیط کشت را جذب کند (George and sherrington , 1984) . نقش تنظیم کننده های رشد ، بیشتر به درصد جذب آنها به وسیله ی زغال فعال نسبت داده شده است ؛ نه اثرات مستقیمی که آنها اعمال می کنند ، اغلب زغال فعال در محیط کشت القا ریشه زایی استفاده می شود . این نقش ممکن است همانند جذب تنظیم کننده های رشد ، به کاهش نور برای افزایش رشد ریشه نسبت داده شود.

3ـ آب

يك جزء حياتي ديگر آب است كه به عنوان يك حلال بيولوژيكي اصلي مورد استفاده قرار می گیرد ( JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985).در کشت بافت معمولا از آب مقطر استفاده می شود و بسیاری از آزمایشگاه ها از آب دو بار تقطیر شده استفاده می کنند. استفاده از ستونهای تبادل یونی برای خالص کردن آب با مشکلاتی همراه است زیرا در این فرایند یکسری ترکیبات آلی از ستون آزاد شده و باعث آلودگی آب می شوند . با این حال ستون های تبادل یونی بدون هیچ مشکلی آب مورد نیاز بسیاری از آزمایشگاه ها را تامین می کنند و به طور گسترده ای در اروپا استفاده می شوند ـ بعضی آزمایشگاه ها به دلیل مسائل اقتصادی از آب باران استفاده می کنند. اما باید توجه داشت که در این صورت از میزان کنترل ما بر روی مقادیر ترکیبات یونی و معدنی محیط کشت کاسته می شود ( Dodd and Roberts ,1985).

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع:

ü رابرتااچ اسميت،ترجمه هدايت باقري وپژمان آزادي،1381، كشت بافت گياهي-تكنيك هاوآزمايشها،انتشارات جهاد دانشگاهي مشهد

ü دكتر افشاري پور سليمان،1372،مباني كشت بافت گياهي، انتشارات دانشگاه علوم پزشكي اصفهان

ü باقري ع وصفاري م،1376،مباني كشت بافتهاي گياهي، انتشارات دانشگاه فردوسي مشهد

ü دكتر پيري خسرو ومهندس نظريان فرهاد،راهنماي كشت بافت گياهي ،1380،انتشارات دانشگاه بوعلي سينا همدان

ü دكتر حسن دخت محمدرضا ومهندس ابراهيمي راحله،1385، مباني كشت بافت گياهي،انتشارات مرز دانش

ü خسروشاهی وبهنامیان،1385، زيست شناسي پايه براي كشت ياخته

ü اكرم م تاجي و همكاران،1382، كشت بافت گياهي

Ø Edwin F. George,Michael A. Hall And Geert-Jan De Klerk;2008;Plant Propagation by Tissue Culture

Ø JOHN H.DODDS &LORIN W ROBERTS ;1985;Plant tissue culture SECOND EDITION;38-53

Ø Trevor A. Thorpe;2007; History of plant tissue culture

Ø Sumit Arora, Jyutika M. Rajwade, Kishore M. Paknikar;2012; Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour

Ø H R Dagla;2012; Plant Tissue Culture Hist

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

سلام

بابت اپلود معلومات مفید و کاربردی شما ممنون

اگر امکان داشته باشد این فایل را در قالب pdf برایم ارسال فرمایید.

با احترام

مشفق

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر
ارسال شده در (ویرایش شده)

با سلام و خسته نباشید

پست مربوطه مربوط به سال 92 میباشد . آیا امکان پیگیری و پایش وسوال وجود دارد یا خیر ؟

ویرایش شده در توسط kiayahmadi
اشتباه

به اشتراک گذاری این ارسال


لینک به ارسال
به اشتراک گذاری در سایت های دیگر

Join the conversation

You can post now and register later. If you have an account, sign in now to post with your account.

مهمان
ارسال پاسخ به این موضوع ...

×   شما در حال چسباندن محتوایی با قالب بندی هستید.   حذف قالب بندی

  تنها استفاده از ۷۵ اموجی مجاز می باشد.

×   لینک شما به صورت اتوماتیک جای گذاری شد.   نمایش به عنوان یک لینک به جای

×   محتوای قبلی شما بازگردانی شد.   پاک کردن محتوای ویرایشگر

×   شما مستقیما نمی توانید تصویر خود را قرار دهید. یا آن را اینجا بارگذاری کنید یا از یک URL قرار دهید.


×
×
  • جدید...